基因工程育种(硕士课程)

（二）电激法
电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上 “电激穿孔”（Electroporation）形成可逆的瞬间通 道，从而促进外源DNA的摄取。该法自1979年 Zimmerann发明以来，经过多年的研究和改进，已广泛 应用于动物、植物的遗传转化研究上。1991年，Royer JC等首先采用电激法把编码二氢乳清酸脱氢酶基因
（5）代表性差异分析（representational difference analysis，RDA）
（6）cDNA扩增片段长度多态（cDNA-amplified fragment length polymorphisms， cDNA-AFLP）
➢实验原理：
➢材料准备
举例： （1）草菇冷诱导基因表达差异片断 （2）耐药性微生物的基因表达差异 （3）不同培养基下漆酶基因表达差异
➢载体构建策略 （１）选择合适的表达载体:含启动子、筛选标记、终
止子 （２）选择合适的限制性内切酶及其酶切位点
➢举例说明 食用菌启动子功能检测载体构建过程
四．遗传转化方法
➢ 原核生物遗传转化
• 热激法 • 电击法
➢ 真菌遗传转化
(一） PEG法
PEG(polyethylene glycol )法最早是由Davey等以 矮牵牛悬浮细胞的原生质体为受体、Krens等以烟草无 菌苗分离的原生质体为受体，在PEG的协助下开创性 地把裸露的DNA直接转化植物原生质体而创立的，他 们的研究结果为基因直接转移到受体细胞奠定了基础。 主要原理：PEG能使细胞膜之间或DNA与膜之间形成 分子桥，促使细胞间的接触和粘连，或是通过引起表面 电荷的紊乱，干扰细胞间的识别，而有利于细胞间的融 合或外源DNA的进入。 主要应用：酵母、蘑菇、平菇、草菇 、鬼伞等
反转录主要依赖于试剂盒完成
Baidu Nhomakorabea
➢接头的设计 原则： （1）选择限制性酶：如Eco R I （5’-GAATTC-3’) （2）PCR引物设计原则 ➢引物的设计
（1）预扩增引物设计 （2）选择性扩增引物设计
➢预扩增结果
➢选择性扩增的优化结果
➢选择性扩增的优化结果
➢片断的回收和测序
ZL41： CCCGATCTCGTGCTGTACGGCGTTCCGTGTGACGCGATCCCGACAATC GCCTTCAACTGGGGCGGCGCCAACTGGACGATCAGTGCGGACAACTTT AATATCGGCCAGGAGGGCAACAGGTGCATCGGCGCCATCTCCGGTCG CGACGTTGGACTCGGTGATAACTCTTGGCTTGTGGGCGATAGGTAAGT CTATCTTCCACGTTGATAATCAATTGTATCGCTGGCTCATGATGAGACG CGTAGCTTCTTGACGGGGGTGTACTCGGCCTTCTCATACGACGACCGG GCCGTGGGCTTCGCCGCTTTGGCTTGATTTTTTTCCCTACACATTTTTG TTTGTTGTGGACGTTGTCCGTCCGAACGCGGTGCTCATGTTGAACATG GGCACGATTGCGCCACGTTGGTTCACCTTACGTATCCTAAGAAACCTG CTTAGCTAGTATGACACTTCTCCAACATATCATTAGATGCTTGCGGGGT ACTCTTGTTCCTTATAGAATCTAAATTCAGAATGATCAGCCCCGGATTC TCAATTTCGGGCACCTTGCGCAATGATTGAATGACGAAATAGGGCCAC ACACAGGTTAAGTATGGCTGTTCTTATCGCGGTGTCGTGTCGCGAATG ATGAACAGCGTTGGTCCCTGTTTGACTGCTTGCGTGTACAGTTATGAT AATACTCAGAAATGTAGCTCAGAACATGGTGACGAATAAACGAAACCC AGCAAGTGCTTATTTACGCCGCGTCACAGCAATTTCAAAATAATATAT ACCTTTCTTAGCTCTA
cloning site） （4） λ噬菌体载体
•表达质粒载体:
组成：启动子，终止子，目的基因，抗性筛选标记基因。
•限制性内切酶及其酶切位点
➢种类：I类、II类、 III类。 I类和III类限制性内切酶 兼有修饰（甲基化）作用以及依赖于ATP的切割活性。 主要存在于生物DNA损伤修复以及抵制入侵DNA。 基因操作常用的限制性内切酶是II类。 ➢II类限制性内切酶特点： （1）识别4-6bp的特异核苷酸序列； （2）产生特异的末端：粘性末端、平端如:
D）银耳肌醇营养缺陷型菌株。
（2）抗生素抗性筛选标记 ： 抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子的
筛选上广泛使用。 主要有： A) 卡那霉素抗性基因（kan+）; B) 氨苄青霉素抗性基因（Amp+) C) 潮霉素抗性基因（Hyg+）; D) 腐草霉素抗性基因（Phl+）; E) 博来霉素抗性基因（Ble+）。
➢技术路线
一号样（最优） 二号样（碳源） 三号样（Cu2+）
酶活变化 最大时
漆酶酶活测定 RNA提取
预扩增PCR 选择性扩增PCR
PCR 条件 优化
cDNA双链合成及纯化
差异显示
TaqI 酶切 TaqI 接头连接
差异片断的分离、回收、纯化 片断连接转化、测序
测序结果的BLAST比对和序列分析
➢总RNA的提取及反转录
一.基因工程在微生物育种的作用
（一）药物的生产：
1.治疗用药物：人干扰素，人胰岛素，人白细胞介素，人 生长素， 动物生长素，松弛素，抑长素，红细胞生 成素，肿瘤坏死因子，表皮生长因子，集落刺激因子， 血小板生长因子，凝血因子，超氧化物岐化酶，尿激 酶，葡激酶等。
2.疫苗：甲肝疫苗，乙肝疫苗，丙肝疫苗，疟疾疫苗，伤 寒及霍乱疫苗，出血热疫苗等。
在培养基中添加抗生素进行筛选。
（3）除草剂和杀菌剂抗性筛选标记 ： A) 如Bialaphos 抗性基因; B)杀菌剂Carboxin抗性基因（CbxR）;
（4）代谢产物抗性筛选标记
如从鬼伞中分离得到的trp3iar基因。该基因是抗氟基吲 哚（5-fluoroindole,5-FL）代谢的，草菇和平菇对潮霉素不 敏感，而对5-FL十分敏感，当把trp3iar 转入草菇和平菇时， 这两种食用菌就能对5-FL产生抗性，达到筛选的目的 。
5）其他：
cel1(cellulose-growth-specific gene )启动子、cel3 启动子、cel4启动子、pri(primase gene )启动子、 gla1(glu-coamylase gene )启动子等。
➢ 筛选标记 （1）营养缺陷型标记 ： 营养缺陷互补标记基因有:
A) ural（二氢乳清酸）基因，杨树菇转化; B) pabl(p-氨基苯甲酸)基因，鬼伞 、蘑菇遗传转化； C）trp2(色氨酸)基因，鬼伞 、蘑菇遗传转化;
（五）环境处理： 构建超级菌株
降解质粒： （1）石油降解质粒； （2）农药降解质粒； （3）工业污染降解质粒，如降解氯联苯、尼龙低聚体、 洗涤剂等； （4）抗金属离子质粒，如汞、砷、镍、钴、镉、铜等
二.目的基因的分离
根据特异蛋白质分离目的基因 根据特异mRNA分离目的基因 利用DNA插入分离目的基因（插入诱变法） 利用基因定位分离目的基因（图位克隆法） 利用表达序列标签分离目的基因 利用同源序列分离目的基因（同源克隆法）
（三）改进传统发酵工艺
好氧微生物在发酵过程中需要耗掉大量的氧气，若氧气不 足产量下降。在生产菌株中转化进血红蛋白基因，可提高生 产菌对氧气的耐受能力。
举例：
谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 发酵生产谷氨酸和谷氨酰胺；
透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb）增 强细胞摄入氧的能力；
Eco RI
5’ -G A A T T C- 3’ 3’ -C T T A A G- 5’
Pst I
5’- C T G C A G -3’
3’- G A C G T C-5’
Hae III 5’-G G C C -3’ 3’-C C G G -5’
•表达载体构建
➢启动子选择
（1）原核生物常用启动子： σ70启动子 （2）植物常用启动子：35S启动子 （3）食用菌常用启动子：
•食用菌常用启动子：
1）ras （Le.ras.gene）启动子；
2）gpd(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)
启动子；
3）spr1(serine proteinase gene )启动子； 4）trp1（tryptophan synthetase gene）启动子；
（3）mRNA差别显示（mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction, DDRT-PCR）
（4）抑制性消减杂交（suppressive subtractive hybridization，SSH）
（1）克隆目的基因；（2）获得高效表达元件（如强 启动子等）；（3）构建高效表达载体（包括转化子筛 选标记）；（4）建立高效转化体系；（5）目的基因 的转化和预期工程菌株的获得；（6）转基因生物的安 全性评价。
内容：
一、基因工程在微生物育种中的作用 二、基因工程载体 三、遗传转化方法 四、基因定位诱变 六、基因工程育种实例
•重组人p53腺病毒 注射液又叫“今又生” 是肿瘤基因治疗药物， 由正常人肿瘤抑制基 因p53 和改构的5型 腺病毒基因重组而成。 前者是今又生发挥肿 瘤治疗作用的主体结 构，后者主要起载体 作用，携带治疗基因 p53进入靶细胞内发 挥作用。
（二）提高菌种的生产能力
1. 提高氨基酸产量：增加基因的拷贝数 2. 提高酶的产量：改造酶基因 3.提高抗生素的产量：抗生素是次级代谢产物， 通过改变生物合成途径中关键酶基因来提高其产 量。
3.单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶， T-细胞及 其亚群，狂犬病毒，风疹病毒，沙眼衣原体，T4, IgE, HCG-ß, 抗肝癌、胃癌、肺癌、白血病等单克隆抗体 及诊断试剂。
•深圳市赛百诺 基因技术有限 公司的工作人 员在基因制品 生产线上进行 操作。这是亚 洲惟一的GMP 标准的基因治 疗产品生产线。
《发酵工程》硕士研究生课程
基因工程育种
Genetic Engineering Breeding
郭丽琼
二0一0年九月二十四日
人工诱变
杂交育种
自然选择
目标微生物
基因工程 育种
代谢调控 育种
➢基因工程育种：通过基因工程的手段把外源基因
导入宿主菌细胞，有目的地改造宿主菌的遗传性状的 一种育种手段。主要包括以下环节：
➢片断的分析
利用同源序列分离目的基因
（同源克隆法） 目的基因相关同源序列
PCR扩增保守序列 筛选基因文库 目的基因全长
三. 基因工程载体
(一）质粒载体的组成
•克隆质粒载体：含抗性基因、自主复制序列（ori） •常用克隆质粒载体
（1）pUC系列（含ampr、 lacZ、Mutiple cloning site） （2）pBR322 (含ampr、tetr、 Mutiple cloning site) （3）Bluescript M13系列（含ampr、 lacZ、Mutiple
结果表明：在溶氧只有5％的条件下,重组菌比野生菌细胞干 重提高了1.2倍,单位细胞谷氨酸的生产能力提高了6.5倍,单 位细胞谷氨酰胺的生产能力提高了1.4倍。（北京理工大学）
（四）提高菌种抗性
如（1）酵母只能在低温进行保存和运输，改变基因使 得酵母能在干燥条件下常温保存和运输。
（2）不耐低温的草菇，转进抗冻蛋白基因使其耐寒。
根据特异mRNA分离目的基因
（1）差别杂交（differential hybridization）, 又称：差别筛选（differential screening）
（2）缩减杂交（subtractive hybridization）， 又称：缩减cDNA克隆（ subtractive cDNA cloning）