蛋白质纯化方法

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蛋 白 质 的 纯 化 方 法
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聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用 聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法， 聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法， 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺 丙稀酰胺和 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺和 甲叉双丙稀酰胺交联而成的多 交联剂甲叉双丙稀酰胺 交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的多 孔网状凝胶。 孔网状凝胶。 不连续PAGE有分离胶、 PAGE有分离胶 不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品 胶。 PAGE分辨率很高 分辨率很高。 PAGE分辨率很高。
等电聚焦
蛋 白 质 的 纯 化 方 法
将两性电解质(eg:pH3将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)同 (eg:pH3 pH5-7)同 蛋白质样品一起加入到已经灌好的 凝胶中，在电场下， 凝胶中，在电场下，两性电解质首 先达到它的等电点而平衡， 先达到它的等电点而平衡，蛋白质 样品根据它自身的等电点分别向两 极移动，最后也达到平衡。 极移动，最后也达到平衡。
等电聚焦：这种按等电点的大小， 等电聚焦：这种按等电点的大小，生物 分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚 分子在 梯度的某一相应位置上进行聚 焦的行为称等电聚焦 等电聚焦。 焦的行为称等电聚焦。
等电聚焦的特点就 在于它利用了一种 称为两性电解质载 体的物质在电场中 构成连续的pH梯度， 使蛋白质或其他具 有两性电解质性质 的样品进行聚焦， 从而达到分离、测 定和鉴定的目的。
离子交换层析法
蛋 白 质 的 纯 化 方 法
凝胶过滤法
蛋 白 质 的 纯 化 方 法 此法又称为分子筛层析。 此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所 分子筛层析 用的介质是由交联葡萄糖 琼脂糖或 葡萄糖、 用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或 聚丙烯酰胺形成的凝胶珠 形成的凝胶珠。 聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的 内部是多孔的网状结构。 内部是多孔的网状结ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。 G10-G200(葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶) Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶) Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶) Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶) Sephacryl S100,S200,S300,S400 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶) (聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶)
蛋 白 质 的 纯 化 方 法 在外加电场作用下， 在外加电场作用下，带电的蛋白质颗 粒在电场中移动的速度（ 粒在电场中移动的速度（v）取决于 电场强度(E) 所带的净电荷(q) (E)， (q)， 电场强度(E)，所带的净电荷(q)，蛋 白质的分子量、 白质的分子量、分子形状以及与介质 的摩擦系数(f) (f)。 的摩擦系数(f)。
电泳过程
SDSSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 蛋 白 质 的 纯 化 方 法 SDS（十二烷基磺酸钠） SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子 型表面活性剂， 型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽 链中的氨基酸残基按大约1 1.4比例 链中的氨基酸残基按大约1 : 1.4比例 结合。 结合。 每一个蛋白质分子都因为结合了许多 SDS而带有大量的负电荷 而带有大量的负电荷， 的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质 分子原有的电荷则可以忽略。 分子原有的电荷则可以忽略。该法主 要利用了蛋白质分子量大小不同而分 离蛋白质。 离蛋白质。 用已知分子量的蛋白质作为标准， 用已知分子量的蛋白质作为标准，则 可以估算出不同蛋白质的分子量。 可以估算出不同蛋白质的分子量。
几种常用的电泳
纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) (可分为圆盘电泳和垂直平板电泳） 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳） 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦(IEF) 等电聚焦 双向电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
分子筛层析的工作原理
也叫凝胶过滤层析
亲和层析法
蛋 白 质 的 纯 化 方 法
这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。 高效分离纯化蛋白的方法 是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的 特殊配基具有不同的识别和结合能力。 特殊配基具有不同的识别和结合能力。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作 用的配基， 用的配基，然后应用化学方法将该配基与载 体共价连接。 体共价连接。将这种连接有配基的载体装入 层析柱中， 层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过 层析柱时， 层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结 合而被吸附在层析柱上， 合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流 出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质， 出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质， 可以用适当的配体洗脱液洗脱。 可以用适当的配体洗脱液洗脱。
亲和层析法
蛋 白 质 的 纯 化 方 法
常用的配基有抗体、抗原、 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋 酶的底物和抑制剂等。 白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼 脂糖凝胶等。 脂糖凝胶等。
蛋白质纯度等的测定
纯度和分子量的测定： 纯度和分子量的测定：采用电泳 如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、 ）、分子 （如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子 筛层析、高速离心、 筛层析、高速离心、高效液相色谱 等技术测定。 等技术测定。 等电点的测定： 等电点的测定：利用等电点时溶解 度最低或等电聚焦方法测定。 度最低或等电聚焦方法测定。 亚基个数的测定：采用SDS SDS聚丙烯酰 亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰 胺凝胶电泳方法测定。 胺凝胶电泳方法测定。
蛋白质双向电泳
银染结果
考马斯亮染色为蓝色
连 续 电 泳
几种常用的层析法 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析
柱层析
离子交换层析法
蛋 白 质 的 纯 化 方 法
此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物， 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物， 将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素, 离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素, 如羧甲基纤维素(CM纤维素 纤维素） 如羧甲基纤维素(CM纤维素）等，阴离子交 换纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（ 换纤维素,如二乙基氨基乙基纤维素（DEAE 纤维素） 纤维素）等。 带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强， 带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而 带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。 带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。 用不同浓度的阳离子洗脱液， NaCl溶液进 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进 行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可 行梯度洗脱，通过Na 的离子交换作用， 以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。 以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。