09第二章 第三节 杀菌剂的生物测定方法
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法一、实验目的掌握抑菌圈法测定杀菌剂的生物活性的方法及步骤。
二、实验原理本实验主要采用抑菌圈法来测定杀菌剂的生物活性。
抑菌圈法是利用杀菌剂在琼脂平板上产生的抑菌效果来对其生物活性进行测定的一种方法。
通常，将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，使其均匀地分布在琼脂上。
然后，将含有细菌培养物的琼脂平板放入恒温箱中进行培养。
在培养一段时间后，观察平板上是否出现了抑菌圈，并测量抑菌圈的直径来评估杀菌剂的生物活性。
三、实验仪器和材料1.显微镜2.恒温箱3.滴定管或移液管4.琼脂平板5.细菌培养物6.杀菌剂溶液四、实验步骤1.准备琼脂平板。
将琼脂平板置于恒温箱中，加热至溶化状态后取出，待其稍微冷却后均匀地倒入培养皿中。
2.滴加杀菌剂溶液。
将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，并用移液管在平板上转动，使杀菌剂均匀地分布在琼脂上。
3.检验杀菌剂效果。
取一定量的细菌培养物，将其在琼脂平板上均匀涂布。
4.培养细菌。
将含有细菌培养物的琼脂平板放入预先恒温箱中，设置合适的温度和培养时间。
5.观察抑菌圈。
在培养一段时间后，取出琼脂平板，用显微镜观察平板上是否出现了抑菌圈。
6.测量抑菌圈直径。
使用直尺或量角器等工具测量抑菌圈的直径，并记录结果。
五、实验注意事项1.操作时要注意无菌技术，以避免细菌污染。
2.滴加杀菌剂溶液时要均匀并轻柔，以保证杀菌剂能充分分散在琼脂平板上。
3.培养细菌时要控制好温度和培养时间，以确保细菌能够充分生长。
4.观察抑菌圈时要注意使用合适的放大倍数，以免错过细小的抑菌圈。
5.测量抑菌圈直径时要使用准确的测量工具，以获得准确的结果。
六、实验结果处理根据实验所得的抑菌圈直径数据，可以通过计算其平均值、标准差等统计指标来评估杀菌剂的生物活性。
较大的抑菌圈直径通常表示杀菌剂具有较强的抑菌效果，反之则表示其抑菌效果较弱。
可以将实验结果与已有的标准值进行比较，以判断杀菌剂的生物活性。
七、实验结果分析根据测得的抑菌圈直径结果，可以对杀菌剂的生物活性进行分析。
杀菌剂的毒力测定方法
生长速率测定法注意事项：
1）带毒培养基的制作
应先加药液再加培养基（1：9）； 对一些受热易分解的药剂则要待培养基 冷却到50度左右时再加入。
2）接种病原菌
如果是菌丝接种，打孔制作菌饼时 取材要从种菌皿的外缘开始，避免使用 中心区的菌丝。
如果是孢子液接种，用接种针蘸取 孢子液后，在带药培养基上划一直线。
6 扩散法
原理：在已接种的培养基上加少量的 抗菌物质，使其接触培养基和病原菌，经 一定时间培养后，接触部分的周围由于抗 菌物质的扩散，而产生抑菌圈（或抑菌 带），其大小与药剂浓度有关系，以此来 比较杀菌剂的毒力大小。
此法主要用于抗生素的效价测定。
农用抗生素的效价
效价是衡量抗生素有效成份和质量好坏的 一个指标。
药剂抗菌力也即药剂毒力。
5 气体效力测定
原理：有些杀菌剂具有挥发性，且有杀 菌特性，在测定这类杀菌剂毒力时，可将麦 芽汁-琼脂培养基置于皿底内，冷凝后接种病 原菌孢子，然后盖上皿盖并倒过来使底成 “盖”，使盖成“底”，并将杀剂菌剂置于 “底”内，放到适于病菌孢子发芽生长的环 境中培养一定时间后观察。
如：嘧啶胺类化合物在室内，以 100ug/ml对灰霉病菌孢子没有抑制作用； 300ug/ml对菌丝生长也不能抑制； 1ug/ml的浓度在田间使用时，却能很好 的防治灰霉病。
药剂与病菌的作用关系
传统的：以其“毒力”抑制或杀死病菌。一 般是一致的。
病菌
药剂
环境
新类型的杀菌剂：
影响病菌的致病过程； 影响寄主的抗病性；
即在各处理组的调查孢子总数中增加调查 孢子数量，增加的数量根据对照组孢子萌发 率换算出来。
如：CK孢子萌发率达98%时，在调查处理 组时，拟定调查数量为100时，此时就要调查 102个，并对其不萌发孢子数减去2，然后计 算孢子萌发率。
杀菌剂生物测定
管碟法
E26细菌素粗提物抑菌活性测定 E26细菌素粗提物抑菌活性测定
2.滤纸片法
操作步骤是：与管碟法不同处在于将药液定 操作步骤是：与管碟法不同处在于将药液定 量地滴加在小滤纸片上(直径1 量地滴加在小滤纸片上(直径1一8mm) 。晾 干，放于带菌的培养基上,,测定抑菌圈直径。 干，放于带菌的培养基上,,测定抑菌圈直径。 特 点：精确度较高,用药量少,操作较简便, 点：精确度较高,用药量少,操作较简便, 应用面广
二、毒力测定方法（离体实验）
菌体生长率测定方法及步骤（续） 菌体生长率测定方法及步骤（续）
②打菌饼：用直径0.4-0.5厘米打孔器在培养好 打菌饼：用直径0.4-0.5厘米打孔器在培养好 的菌落外缘切下菌饼。 ③移植菌饼：用消毒接种针或镊子将切好的菌饼 反转移植到含药的培基上, 反转移植到含药的培基上,置于菌的适宜生长条 件下培养 ④测量 测量菌饼扩展的直径,与不混药对照菌盘 测量菌饼扩展的直径, 扩展的直径相比, 扩展的直径相比,求出药剂的抑制生长率。结果 表示方法有：一是一定时间内菌落直径的大小； 二是菌落达到一定直径所需时间。常用前者表示。
• 优点：易于控制、操作简便迅速、精确度
较高。 • 缺点：测定结果与生产实际距离较大，而 有些化合物必须在寄主植物体内活化后才 起杀菌作用
二、毒力测定方法（离体实验）
•孢子萌发法(spore germination methods) 孢子萌发法(spore
通过药剂与病菌孢子接触后, 通过药剂与病菌孢子接触后,根所抑制病菌 孢子萌发率来判定药剂效力。此法可用於筛 选杀菌剂、药剂毒力及作用方式的测定。
生 长 速 率 测 定 法
生 长 7
生 长 3
HX HX HX HX 2
杀菌剂生物测定实验报告
多菌灵对小麦赤霉病病菌菌丝生长的毒力测定一、实验目的：掌握生长速率法的基本操作二、实验基本原理：琼脂平板培养法是在融化的培养基中加入一定浓度的杀菌剂，制成含梯度浓度药剂药剂的培养基平面，再在平面上接种病原菌。
以病原菌生长速率为指标评价药剂的毒力。
病原菌生长速率通常采用在一定时间内病原菌生长的菌落直径大小（即扣除接入病原菌菌落直径）表示，也可用菌落达到一定直径所需时间表示。
在测定中一定要同时设置不加药剂和只加药剂配置时的溶剂和助剂的空白对照，用于在计算毒力时溶剂和助剂对结果的影响。
该方法尤其适合在琼脂培养基上能够沿水平方向有一定生长速率且菌落接近于圆形的病原真菌或者在液体培养基中能够迅速培养的病原细菌。
三、实验步骤1，菌碟制备：以小麦赤霉病菌作供试菌株，取灭菌培养皿一套，分别加入已融化的马铃薯培养基17ml制成平板。
取已经活化的小麦赤霉病病原菌菌种一支，在培养皿中央分别接入赤霉病病原菌，置于25C恒温箱内倒赔84h后，用内径为5mm的打孔器沿菌落外周处打一周，制成菌碟。
2，含梯度浓度药剂平板的制备（1）药剂浓度处理设置处理药剂浓度为 0、0.125、0.25、0.5、1和2ppm，每处理3个重复。
（2）制备药剂母液用分析天平称取0.01g多菌灵原药，先加入到1ml 0.1mol/L盐酸水溶液中，再加9ml灭菌水，摇匀，制成1000ppm的母液（3）制备对照平板用量筒分别量取50ml培养基均匀家去到3个灭菌的培养皿中，制成对照平板（4）制备药剂浓度梯度在灭菌的三角瓶中用移液器先加入180ul母液，再用量筒1量取90ml培养基加入到三角瓶中，摇匀，用已灭菌的量筒2量取45ml 摇匀然后加入到无菌培养皿中，制成2ppm的含药平板，并标注。
以此重复上述过程，制成1ppm、0.5ppm、0.25ppm、0.125ppm的含药培养基平板。
3，接菌、培养和结果调查用接种针分别在含药培养基平板中央接入菌碟（气生菌丝朝上），每皿一个菌碟，在25度恒温箱内倒置培养72h，采用十字交叉法测量每皿菌落的直径。
杀菌剂测定标准
杀菌剂测定标准引言杀菌剂是一种用于防治病原菌和其他有害微生物的化学物质。
为了确保农产品安全和食品卫生，必须建立一系列的杀菌剂测定标准，以便监测和控制使用杀菌剂的数量和质量。
杀菌剂测定的重要性杀菌剂在农业生产中广泛应用，但过量或不适当的使用可能会对环境和人体健康造成危害。
因此，建立科学合理的杀菌剂测定标准非常重要。
食品安全杀菌剂残留在食品中可能对人体健康产生不良影响。
合理的杀菌剂测定标准能够确保食品的质量和安全，防止过量残留。
环境保护如果杀菌剂过量使用或使用不当，可能会导致土壤和水源污染，对生态环境产生危害。
通过建立测定标准，监测和控制杀菌剂的使用，可以减少对环境的负面影响。
农业可持续发展合理使用杀菌剂有助于农作物的健康生长和增产。
杀菌剂测定标准的制定可以帮助农民选择和正确使用合适的杀菌剂，提高农作物质量和农业生产效益。
杀菌剂测定标准的制定过程1. 收集相关信息为制定科学合理的杀菌剂测定标准，需要首先收集相关的科学研究和实践经验。
这些信息包括杀菌剂的毒理学特性、残留分析方法、最大残留限量等。
2. 确定测定方法根据收集到的信息，选择合适的测定方法对杀菌剂进行定量分析。
常用的测定方法包括色谱法、光谱法、质谱法等。
在选择方法时，需要考虑方法的准确性、灵敏度、重复性等因素。
3. 确定最大残留限量最大残留限量是指允许产品中残留的最高杀菌剂浓度。
确定最大残留限量需要综合考虑食品卫生、环境保护和农业生产等因素。
一般通过风险评估来确定最大残留限量的值。
4. 制定标准文件根据确定的测定方法和最大残留限量，制定详细的标准文件。
标准文件应包括测定方法的详细描述、结果解释方法、标准样品的准备方法等内容。
杀菌剂测定标准的应用1. 监测工具杀菌剂测定标准提供了监测工具，用于检测和监测食品中的杀菌剂残留情况。
这些监测工具可以帮助相关政府部门和机构监管农产品质量和安全。
2. 产品质量控制杀菌剂测定标准可以帮助生产企业控制产品的质量。
杀菌剂生物测定技术共92页文档
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
40、人类法律，事物有规律，这是的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
农药生物测定
▪ 优点：快速、试验当天即可得结果
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法 ▪ 1、萌发表面的处理 ▪ 萌发表面是孢子萌发的场所，必须符合以下条件： ▪ A.对孢子的萌发即无抑制作用又无促进作用； ▪ B.能使承受的液滴展布面积一致。
菌，以病菌的生长进度快慢来判定药剂毒力的大小。
▪ 病菌生长速度表示方法
▪ （1）药剂达到一定大小所需时间；
▪ （2）一定时间药剂直径的大小。
▪ 优点：操作比较简单；重现性好；病菌易于培养。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定
（二）含毒介质培养法
▪ 2、生长速率法
▪ 步骤：
▪ 1、配制药液
▪ 2、制备带毒培养基
▪ 3、打制菌饼
▪ 4、移菌饼
▪ 5、培养（定时间或定半径）
▪ 6、结果检查
对照的菌落直径－处理的菌落直径
生长抑制率（%）＝
对照菌落直径
×100
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
一、杀菌剂皿内生物测定
（一）孢子萌发法 ▪ 4、高温、保湿培养
▪ 温度、湿度、pH、氧气
▪ 5、结果检查及表示
▪ 一定时间后检查孢子萌发率，一般在低倍镜下，随机检查200个孢子 ▪ 标准：孢子芽管大于孢子的短半径时，即算萌发，否则不算萌芽
杀菌剂生物测定
第一节 体壁的构造与功能
4.搅乱寄主和病菌间的生长关系，增强植物抗病性
提高寄主的抗病性
烯丙苯噻唑（probenazole）防治稻瘟病，又叫噻瘟唑
离体下对稻瘟病菌几乎无毒性，但是在水稻植株体内能够
启动防卫机制，诱导寄主细胞形成木质素化壁等物理屏障，阻 止病原菌进一步向邻近细胞蔓延；诱导寄主植物产生和积累
孢子萌发表面
普通的载玻片
普通的 载玻片 洗 液 10min 自来水冲 洗干净 蒸馏水 冲洗 防尘条件 下干燥
缺点：
供试菌的孢子悬浮液（或与药剂混合液）滴在
第一节 体壁的构造与功能
一、杀菌剂的毒杀作用方式
同一种药剂，由于使用浓度、处理时间的不同可能表
现出不同的毒杀作用方式。
生产上，为了保证对植物的安全和节约用药，一般多 利用杀菌剂的抑菌作用，因为这样（抑制病菌孢子萌 发或病菌生长）就能达到防病的目的。
但为了研究杀菌剂的作用机制，就必须区分清楚毒杀
本节重点
杀菌剂对病菌的毒杀作用方式 杀菌剂生物测定技术的基本类型
第二节 杀菌剂毒力、药效测定的基础操作及原理 一、试验器材的清洁及灭菌
常用的洗涤剂
试验器材的灭菌
二、植物病原菌的培养
培养基
菌种的培养与保存
一、试验器材的清洁及灭菌
（一）常用的洗涤剂
洗液
K2Cr2O7重铬酸钾（60g）+ 浓H2SO4（460mL）+水（300mL）
的作用。
杀菌剂毒力、药效测定方法尽管多种多样，但它的基本原 理离不开杀菌剂的毒力作用方式和使用方式。
一、杀菌剂的毒作用方式 二、杀菌剂的使用方式
三、杀菌剂生物测定技术的基本类型
实验十二杀菌剂的生物测定孢子萌发法
三、实验步骤 （1）药剂配制
水溶性药剂直接用无菌水溶解稀释 其他药剂选用合适的溶剂（如丙酮、二甲基亚砜、 乙醇等）溶解，用0.1%的吐温80无菌水溶液稀释。根 据预备试验，设置5-7个系列质量浓度，有机溶剂最终 含量不超过2%。
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（2）孢子悬浮液配n）5min
实验十二 杀菌剂的生物测定——孢子萌发法
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一、试验目的 学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一------孢子萌发法。 二、试验原理
将孢子培育在含有一定药剂的介质中，在保温、保湿 条件下培养一定时间后镜检，根据杀菌剂对病原真菌孢子 萌发抑制作用来测定药剂的生物活性。
载玻片
含药介质
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孢子
校正(萌 % 发 对 ) 1率 照 0对 0萌 处 照 发 理 萌 率 萌 发 10发 0 率率
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实验结果统计
处理 浓度ppm 浓度对数 检查孢子总数 孢子萌发数 孢子萌发% 更正萌发% 机率 硫酸铜
多菌灵 CK
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● 计算各处理的孢子萌发相对抑制率，采用浓度对数-几率 值法计算各药剂的EC50、EC90,标准误及其95%置信限，评价供 试药剂对靶标菌孢子萌发的抑制活性。
倒去上清液，加入去离子水
离心
去离子水将孢子重悬浮 （每毫升1×105-1×107个孢子，并加入0.5%葡萄糖溶液）
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（3）药剂处理
低浓度
药液
0.5mL
高浓度
孢子悬浮液 0.5mL
混合均匀 微量加样器
凹玻片
然后架放于带有浅层水的培养皿中，加盖保湿培养于适宜温度的培养箱中。
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四、结果调查与统计分析
当空白对照孢子萌发率达到90%以上时，检查各处理孢子萌发情况。 每处理各重复随机观察3个以上视野，调查孢子总数不少于200个，分别 记录萌发数和孢子总数。孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。同 时还应观察记录芽管生长异常情况、附着胞形成数等。
杀菌剂毒力测定
时，每重复了随机观察3个以上视野， 调查孢子总数不少于200个，分别记 录萌发数和孢子总数。
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Determining fungicide inhibition of pathogen spore germination on concave slides
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一、杀菌剂毒力测定方法
4 扩散法 管碟法： 在试验平面上放4个牛津杯（外径8mm，
内径6mm，高10mm）。用移液管将已 知浓度的标准液和不同浓度的待测液 移圆筒内，在适温下培养，让其形成 抑菌圈。测其直径。
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一、杀菌剂毒力测定方法
4 扩散法：农用抗菌素效价测定
抗菌素效价的衡量单位分两类：
一般规定孢子的浓度最好是5万/ml。 15 10*10观察时，每个视野约有35个。
一、杀菌剂毒力测定方法 孢子浓度可用计数器测定 纽鲍尔（Neubauer）血球计数器。 边长为0.05mm的小方格，深度为
0.1mm
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一、杀菌剂毒力测定方法
1.4 孢子萌发条件 A、温度：各种真菌孢子萌发的最适
6. 数据处理 计算校正的孢子萌发率，求出毒力回
归线，EC50，EC90及95%置信限。
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一、杀菌剂毒力测定方法
2 生长速率法(mycelium growth rate test)
将不同浓度的药液与融化的培养基混 合，制成带毒培养基平面，在平面上 接种病原菌，以病原菌生长速度快慢 来判定药剂毒力大小。
玉米小斑病菌孢子，适当加入一点玉 米苗的新鲜汁液，在26℃下2h，孢子 萌发率高，整齐。
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一、杀菌剂毒力测定方法
1.5 调查方法 一般病菌培养20~24小时即可镜检。
实验二 杀菌剂生物活性测定
杀菌剂生物活性测定-生长速率法一、实验原理将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌生长速度的快慢来判定药剂毒力的大小。
病菌生长速率可用两种方法表示：①一定时间内菌落直径的大小；②菌落达到一定直径所需的时间。
二、实验目的通过本试验要基本掌握杀菌剂室内（离体）活性的生物测定操作技术，掌握杀菌剂毒力回归曲线的制作及LC50的求解。
三、实验材料1．供试药剂：70%甲基托布津 2．供试病原菌：苹果炭疽病菌3．马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（PDA）配方：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉10g（或琼脂条18g）；自来水10 00 mL；pH自然偏酸（5-6）制作方法：选择质量较好的马铃薯，削皮，去芽眼，切成薄片，称取200g，加自来水1000mL，煮沸后改小火煮30min（直至马铃薯片呈半透明状），然后用4层沾湿纱布过滤，滤液用水补足至1000mL。
再加入琼脂10g，用玻棒搅拌使其溶解（可适当加热）后加入葡萄糖20g，搅匀，再补足水1000 mL，最后分装于试管（用于接斜面）或三角瓶（250mL三角瓶盛约150mL培养基），用无菌封口膜封好灭菌备用。
采用湿热灭菌法，121℃下保持30min。
4、实验器材：φ90cm的培养皿（72个），PDA培养基，1mL移液管（10个），酒精灯，10mL具塞刻度试管（10个），接种针（4个），超净工作台（2台）。
四、方法与步骤1．菌种准备实验室准备有菌源，在生测前一个星期请自行转接。
对菌种的要求：病原菌应容易培养，菌丝生长快速、整齐，产生孢子缓慢；菌丝最好在培养基平面上呈平伏放射状生长（有利于结果的测量）。
在φ90cm的培养皿中，倒入约10-15mL PDA。
从培养皿或者斜面培养基上取一块病菌，放在培养皿中间，于26℃下培养（3-7d）备用。
2．药液准备将供试药剂70%甲基托布津用无菌水分别稀释成800、400、200、100、50、25mg/L 六个浓度的药液。
4.3-杀菌剂毒力测定
第一单元：农药生物测定与田间药效试验1.杀菌剂生物测定（Bioassay of fungicides）利用病原菌或感菌生物体对杀菌剂的反应，来确定杀菌剂效力（毒力，药效）的农药生物测定。
2.杀菌剂的毒力测定方法（1）基于离体平板培养的毒力测定方法（2）活体测定法（3）组织筛选测定法（1）基于离体平板培养的毒力测定方法①孢子萌发测定法原理：在载玻片或平板上，通过滴加、喷施等方法将药液施于其上，然后滴加一定浓度的孢子悬浮液，经过一定时间培育后在显微镜下观察孢子的萌发率。
一般在低倍镜下，每处理随机检查200个孢子。
毒力越大的药剂，孢子萌发抑制率也越大。
%100⨯=检查孢子数萌发孢子数孢子萌发率%100-⨯=对照萌发率处理萌发率对照萌发率孢子萌发抑制率（1）基于离体平板培养的毒力测定方法②抑菌圈法此法先将病原菌孢子或菌丝的悬浮液与培养基混匀，待混合物冷却后，在培养基表面利用各种方法（管碟法、滤纸片法、孔碟法）使药液和培养基接触，培养一定时间后，由于药剂的渗透扩散作用，施药部位周围的病原菌被杀死或生长受到抑制，从而产生抑菌圈。
毒力越大的药剂，抑菌圈也越大。
该方法所用药剂需有较好的水溶性。
（1）基于离体平板培养的毒力测定方法③生长速率测定法此法的原理是趁热在培养基中加入药液，混合均匀后冷却，然后在无菌条件下将病原菌接入装有培养基的培养皿中央，经过一定时间培育后观察病原菌菌丝的生长情况。
毒力越大的药剂，菌丝的生长越缓慢。
此法多用于不产孢子或产孢子量少而菌丝较密的真菌。
病原菌生长速率的表示方法有2种：①菌落达到一定大小所需的时间；②单位时间内菌落的直径大小。
该方法的优点是操作简便，适用范围广，重复性好。
但对病原菌要求严格，病菌易于培养，生长较快且边缘整齐，产孢子缓慢；供试药剂遇热不易分解。
（1）基于离体平板培养的毒力测定方法④对峙培养法将天然提取物及病原菌同时放在同一个有培养基的培养皿的两边，经过一定时间培育后观察菌丝生长的情况。
杀菌剂生物测定实验报告
多菌灵对小麦赤霉病病菌菌丝生长的毒力测定一、实验目的：掌握生长速率法的基本操作二、实验基本原理：琼脂平板培养法是在融化的培养基中加入一定浓度的杀菌剂，制成含梯度浓度药剂药剂的培养基平面，再在平面上接种病原菌。
以病原菌生长速率为指标评价药剂的毒力。
病原菌生长速率通常采用在一定时间内病原菌生长的菌落直径大小（即扣除接入病原菌菌落直径）表示，也可用菌落达到一定直径所需时间表示。
在测定中一定要同时设置不加药剂和只加药剂配置时的溶剂和助剂的空白对照，用于在计算毒力时溶剂和助剂对结果的影响。
该方法尤其适合在琼脂培养基上能够沿水平方向有一定生长速率且菌落接近于圆形的病原真菌或者在液体培养基中能够迅速培养的病原细菌。
三、实验步骤1，菌碟制备：以小麦赤霉病菌作供试菌株，取灭菌培养皿一套，分别加入已融化的马铃薯培养基17ml制成平板。
取已经活化的小麦赤霉病病原菌菌种一支，在培养皿中央分别接入赤霉病病原菌，置于25C恒温箱内倒赔84h后，用内径为5mm的打孔器沿菌落外周处打一周，制成菌碟。
2，含梯度浓度药剂平板的制备（1）药剂浓度处理设置处理药剂浓度为 0、0.125、0.25、0.5、1和2ppm，每处理3个重复。
（2）制备药剂母液用分析天平称取0.01g多菌灵原药，先加入到1ml 0.1mol/L盐酸水溶液中，再加9ml灭菌水，摇匀，制成1000ppm的母液（3）制备对照平板用量筒分别量取50ml培养基均匀家去到3个灭菌的培养皿中，制成对照平板（4）制备药剂浓度梯度在灭菌的三角瓶中用移液器先加入180ul母液，再用量筒1量取90ml培养基加入到三角瓶中，摇匀，用已灭菌的量筒2量取45ml 摇匀然后加入到无菌培养皿中，制成2ppm的含药平板，并标注。
以此重复上述过程，制成1ppm、0.5ppm、0.25ppm、0.125ppm的含药培养基平板。
3，接菌、培养和结果调查用接种针分别在含药培养基平板中央接入菌碟（气生菌丝朝上），每皿一个菌碟，在25度恒温箱内倒置培养72h，采用十字交叉法测量每皿菌落的直径。
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水溶性药剂、乳油稀释液或稳定的悬浮液（胶悬剂的稀释液）可用此
法，而WP由于是悬浮性差，不宜采用。 优点：操作简单迅速，无需特殊设备
缺点：药剂和孢子始终充分接触，与病害防治的实际相差很大，测得
的毒力往往偏高。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
二、杀菌剂温室植株测定方法
针刺法测定农药对番茄灰霉病防治效果的活体试验
二、杀菌剂温室植株测定方法
对照（3d）
40%多菌灵WP1500×（3d）
一种植物精油1000×
针刺法测定农药对番茄灰霉病防治效果的活体试验
二、杀菌剂温室植株测定方法
盆栽法测定农药对小麦白粉病的防治效果
二、杀菌剂温室植株测定方法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
3、孢子悬浮液的准备
菌种
无菌水，搅匀
菌种悬浮液
二层纱布过滤 除去菌丝体及破碎培养基
离心 无菌水洗
洗净的孢子
调至浓度5000个/mL（10×10倍，35个孢子）
Байду номын сангаас
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
3、孢子悬浮液的准备
菌种应是标准菌种，供试菌种应符合以下条件： ①菌种纯粹，在一般培养基上易大量产生孢子； ②多代繁殖不易产生变异； ③孢子个体较大，易于在显微镜下观察萌发情况；
④在分类上有一定的代表性，而且是重要的植物病害病原菌。
2、生长速率法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （二）含毒介质培养法
3、最低抑制浓度法
基本原理：药剂按等比或等差数列配制成系列浓度，与培养基混合
后接入供试菌，培养一段时间，找出终点浓度（明显抑制供试菌生长
发育的稀释倍数，即最低浓度） ，即为最低抑制浓度。
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法 4、高温、保湿培养
温度、湿度、pH、氧气
5、结果检查及表示
一定时间后检查孢子萌发率，一般在低倍镜下，随机检查200个孢子
标准：孢子芽管大于孢子的短半径时，即算萌发，否则不算萌芽
抑制孢子萌发率（%）＝ 对照孢子萌发率－处理孢子萌发率 对照萌发率 ×100
马铃薯茎线虫（Citylenchus destructor Thorne）
葱线虫（Ditylenchus allil (Beijerinck)） 菊线虫（Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz)）
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
四、 杀线虫剂的生物测定 （二）测定方法 1、非熏蒸的生物测定 2、熏蒸剂的毒力测定
优点：精确度高，操作简单，很快可得到结果。 缺点：测定结果受药剂溶解后和扩散能力影响很大，有一定局限性， 另外，对严格的寄生菌不适合。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （二）含毒介质培养法 2、生长速率法 基本原理：将不同浓度的药液和培养基混合，用这种培养基培育病
（四）发病条件的创造
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
二、杀菌剂温室植株测定方法 （五）施药 1、测定药剂的保护效果，先喷药后接菌。
2、测定药剂治疗效果，先接菌后喷药（传染后1~2d）。
3、测定药剂的内吸效果：植株上，先喷药后接菌；土壤中，
前施药后接菌）。
4、测定药剂药效期：一次施药，1，2，4，6，8d后接菌。
菌，以病菌的生长进度快慢来判定药剂毒力的大小。
病菌生长速度表示方法
（1）药剂达到一定大小所需时间； （2）一定时间药剂直径的大小。
优点：操作比较简单；重现性好；病菌易于培养。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （二）含毒介质培养法 2、生长速率法 步骤：
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
二、杀菌剂温室植株测定方法
利用盆、钵培育幼嫩植物进行生测，是研究杀菌剂有效方法之一。 盆栽试验法克服了在离体条件下对病菌无效而在活体条件下有效的
化合物的漏筛。同时，也更接近大田实际，对实践有指导价值。另
外，材料易得、易控制。
因此，在当前的杀菌剂测定研究中，越来越重视盆栽试验法，有些
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 二、杀菌剂温室植株测定方法
三、植物病毒防治剂药效测定方法
四、杀线虫剂的生物测定
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
是历史最悠久而被广泛利用的杀菌剂毒力测定方法。 基本原理：将供试药剂附着在载玻片上或其它平面上，然后将供试 病菌孢子悬浮液滴在上面（或将孢子悬浮液与药液混合后滴在玻片 上），在保温、保湿条件下培养一定时间后镜检以孢子萌发力判断 杀菌剂毒力。 优点：快速、试验当天即可得结果
1、配制药液 2、制备带毒培养基 3、打制菌饼 4、移菌饼 5、培养（定时间或定半径） 6、结果检查
生长抑制率（%）＝ 对照的菌落直径－处理的菌落直径 对照菌落直径 ×100
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
2、生长速率法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （二）含毒介质培养法 1、水平扩散法（又叫抑菌圈法或平面法）
基本原理：病菌先接于培养基表面，再使用多种方法使药剂和培养基 接触，定量培养一定时间，因药剂的渗透扩散作用，施药部位病菌被
杀死或生长受到抑制，从而产生了抑菌圈。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
1、萌发表面的处理
③使用凹玻片 适于：宜滴加孢子悬浮液和杀菌剂的混合液，后再加孢子悬浮液。 不适于：喷粉或喷雾，造成药剂在凹处较多的沉积
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法 2、药剂在玻片上的附着
分类：液体培养基稀释法；固体培养基稀释法。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （三）叶碟法
简易，能在室内进行，较孢子萌发和含毒介质培养接近生产实际 可看做是盆栽试验的过渡阶段。
基本原理：
将易染病的植物叶片（蚕豆叶片）经不同浓度的药剂处理，放于培 养皿内；再将一块培养好的供试菌菌丝体（如纹枯病菌）放在叶片 上；保湿培养一段时间后，检查其病斑面积，以此测定药剂毒力。
二、杀菌剂温室植株测定方法 例：小麦白粉病分级标准
0级：叶面无病斑。 1级：叶片上只有少量有限菌丝体，无孢子。 2级：叶面菌丝体量中等，有一些孢子，组织轻微坏死和褪绿。 3级：菌丝体量较多，孢子产生量有限，组织轻微坏死和褪绿。 4级：孢子堆很大，产生大量孢子，组织大面积坏死。 病情指数=∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×最高分级数） ×100 防治效果（%）=（对照病指增长率－处理病指增长率）/对照病指增长率 ×100
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
1、萌发表面的处理
①普通的载玻片 蒸馏水洗 洗液10min 自来水冲洗干净 供试验用
防尘条件下干燥
缺点：供试菌的孢子悬浮液（或与药剂混合后）滴在载玻片上形成的 液滴展布面积很小，呈球状，作“悬滴”时易失落，此外，液滴间的
展布面积相差较大，试验误差也较大。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
1、萌发表面的处理
②火棉胶薄膜法 5%火棉胶
无水乙醚
0.25%火棉胶
方法：用镊子夹取清洁干燥的玻片浸入火棉胶乙醚溶液后立即取出， 待多余的流去，无尘条件下室温干燥10h以上。 特点：处理过的玻片上覆盖一层透明均匀膜，滴上的孢子悬浮液滴在 玻板上展布较大的面积，而且面积大小比较均匀。
玉米线虫病病症
本章重点
杀菌剂生测的内容及应用范围 何谓之杀菌剂生物测定 试从杀菌剂毒杀作用方式及其使用方法，分析杀菌剂生物测 定技术基本类型 掌握杀菌剂生物测定中的一些技术：孢子萌发法、生长速率 法、杀菌剂盆栽药效试验法等
公司在进行活性筛选时，甚至只用盆栽法，而淘汰离体试验法。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
二、杀菌剂温室植株测定方法 （一）供试植物
1、应是易栽培，生长迅速，且是国内主要农作物； 2、植物发病是盆栽试验的基础，应选感病品种。
（二）供试病菌 （三）接菌
据主要传播方式和侵染途径，确定接菌方式。低倍镜20~30个孢子
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
1、萌发表面的处理
萌发表面是孢子萌发的场所，必须符合以下条件： A.对孢子的萌发即无抑制作用又无促进作用； B.能使承受的液滴展布面积一致。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
二、杀菌剂温室植株测定方法 （六）效果调查 1、调查发病普遍率 以病害发生普遍与否来表示药剂的防效。 2、计数法 适于叶斑类病害，调查每叶病斑数，以此比较计算防效。 3、分级计数法