植物基因启动子的克隆方法及其应用

分子植物育种，２００６年，第４卷，第３（Ｓ）期，第８５－９１页

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３（Ｓ），８５－９１

专题报告

Ｒｅｖｉｅｗ

植物基因启动子的克隆方法及其应用

尹辉李丹张毅李秋莉﹡

辽宁师范大学生命科学学院，大连，１１６０２９

﹡通讯作者，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ

摘要植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点，启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多，从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到ＰＣＲ方法的应用，此后相继问世的一些基于ＰＣＲ的克隆启动子技术，如载体锚定ＰＣＲ、反向ＰＣＲ、接头ＰＣＲ、交错热不对称ＰＣＲ等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法。本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法，分析了它们的优缺点，并展望了今后的研究前景。

关键词启动子，启动子陷阱技术，反向ＰＣＲ，锚定ＰＣＲ，交错热不对称ＰＣＲ

ＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ

ＹｉｎＨｕｉＬｉＤａｎＺｈａｎｇＹｉＬｉＱｉｕｌｉ＊

ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬｉａｏｎｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ，１１６０２９

﹡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ

ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｔｈｅｈｏｔｓｐｏｔｓｔｕｄｙｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｌｏｎｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｓｔｕｄｙｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｆｒｏｍｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｕｓｅｄｗａｙｔｈａｔａｐｐｌｙｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇｆｏｒｃｈｏｏｓｉｎｇｐｒｏｍｏｔ－ｅｒｔｏｔｈｅｕｓｉｎｇｏｆＰＣＲ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｌｏｔｓｏｆｗａｙｓｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｂａｓｅｄｏｎＰＣＲｆｏｒｐｒｏｍｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇｓｕｃｈａｓＡ－ＰＣＲ，Ｉ－ＰＣＲ，ＬＡ－ＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｙｏｆ－ｆｅｒｅｄｍｏｒｅｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄｒｅａｓｏｎａｂｌｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｓｏｍｅｗａｙｓｏｆｃｌｏｎｉｎｇｐｌａｎｔｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｗａｙｓｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｐｒｏｓｐｅｃｔｗａｓａｌｓｏｄｉｓ－ｃｕｓｓｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．

ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｒｏｍｏｔｅｒ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇ，Ｉ－ＰＣＲ，ＡｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ

启动子是ＲＮＡ聚合酶能够识别并与之结合、从而起始基因转录的一段ＤＮＡ序列，是基因表达调控的重要元件。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。植物基因启动子的克隆，对研究植物基因表达调控和构建表达载体至关重要。本文就近几年来克隆植物基因启动子的各种方法做一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。

１植物基因启动子克隆的几种方法

１．１利用常规ＰＣＲ技术克隆启动子

对于序列已知的启动子，只需要根据已知的启动子序列设计引物，然后采用ＰＣＲ扩增的方法就可以获得该启动子。该方法比较简便快捷，是近年来使用较为广泛的一种方法。

王利军等（２００４）根据ＧｅｎＢａｎｋ中拟南芥基因组序列中ａｔｓ１Ａ（核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶小亚基）基因启动子的序列设计引物，以拟南芥总ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出ａｔｓ１Ａ的基因启动子区片段，将其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，得到重组质粒并且进行测序，序列分析表明，所克隆的片段为１１１７ｂｐ，与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ａｔｓ１Ａ基因启动子序列比较，发现只在－７７６位缺失１个碱基。

该方法简便、快捷、操作简单，但不能克隆到全新的启动子。

分子植物育种

ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ

１．２通过构建及筛选基因组文库来克隆启动子该方法首先要提取基因组ＤＮＡ，用限制性内切酶消化，产生出适合于克隆的ＤＮＡ片段，然后在体外将这些ＤＮＡ片段同适当的λ噬菌体载体连接成重组体分子，并转化到大肠杆菌的受体细胞中，构建基因组文库。将构建好的基因组文库铺板，转移到尼龙膜上，用部分已知序列的片段或特异的基因片段做探针进行杂交，筛选出具有目的启动子的克隆，测序分析即可获得该启动子。

Ｒｉｎｅｈａｒｔ等（１９９６）利用此方法，通过筛选海岛棉基因组文库，克隆了纤维发育中后期特异表达基因ＦｂＬ２Ａ的上游序列，它具有启动子的基本特征，包含了启动子所必须的ＴＡＴＡ框等结构。Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ和Ｔｒｉｐｌｅｔｔ（１９９９）也用此方法获得了纤维发育次生壁增厚时期特异表达的长为２．６Ｋｂ的ＧｈＣｅｓＡ４启动子，通过与报告基因ＧＵＳ融合，转化棉花，结果发现在次生壁合成阶段，ＧＵＳ的表达显著增强，与纤维素的合成成正比关系。

此方法需要构建基因组文库，工作量大，但如果已知部分启动子序列，可以使用该方法。

１．３利用载体或染色体步行技术克隆基因启动子１．３．１启动子陷阱技术

利用启动子陷阱技术筛选启动子是一种常用的方法。它是利用启动子缺失的报告基因构建启动子探针质粒，通过报告基因的表达来克隆有启动功能的ＤＮＡ片段。在该技术中关键是要构建一种启动子探针载体。这种载体系统应该满足这样的要求：（１）报告基因经启动子启动后，基因产物应便于鉴定，方便筛选；（２）报告基因经启动子启动后，基因产物应易于量化，最好是某种酶；（３）除了带有通常的抗生素抗性基因以外，载体上还应有第二个选择标记；（４）紧靠着报告基因的上游应有数个克隆位点；（５）质粒稳定存在，拷贝数已知。

利用启动子陷阱技术筛选启动子的过程为：先选用一种适当的核酸内切限制酶消化切割染色体ＤＮＡ；接着将切割产生的ＤＮＡ限制片段群体与无启动子的质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；然后再把重组混合物转化寄主细胞，构成质粒载体基因文库，检测报告基因的表达活性，报告基因若具有活性，则其上游的ＤＮＡ片段即具有启动子活性。

张晓宁（２００２）用启动子探针载体ｐＥＣＥ７克隆了盐藻耐盐基因的启动子。ｐＥＣＥ７具有完整的新霉素抗性基因转录单元和氯霉素抗性（氯霉素乙酰转移酶）基因，可在大肠杆菌中正常复制，但缺少表达氯霉素乙酰转移酶基因所需的启动子序列。该基因含有自身的核糖体结合位点，其５’端有一个ＥｃｏＲⅠ克隆位点，供外源ＤＮＡ片段插入。如果插入的外源ＤＮＡ片段具有启动子活性，该基因即可表达，含有此质粒的细菌就可以在含有氯霉素的抗性平板上正常生长。他们用ＥｃｏＲⅠ酶切盐藻基因组的ＤＮＡ，再与用ＥｃｏＲⅠ酶切后的ｐＥＣＥ７相链，转化大肠杆菌，从新霉素和氯霉素抗性平板上筛选重组子，得到一个双抗重组子。为了保证转化的抗性表现确实来自于盐藻启动子的作用，提取重组子的质粒，重新转化大肠杆菌，用氯霉素筛选，同样得到转化子。经酶切和电泳分析，证明重组质粒与原来的ｐＥＣＥ７大小和结构均一致，从而证明大肠杆菌的氯霉素抗性确实来自外源质粒的氯霉素抗性基因的活性表达，也证明插入的片段在盐藻中具有启动基因表达的功能。

此方法的优点是不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了设计引物，并可获得大量的未知序列启动子片段。

１．３．２锚定ＰＣＲ技术

锚定ＰＣＲ（ａｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ）是由Ｈｕａｎｇ等（１９９３）提出的扩增已知序列侧翼未知片段的方法。反应中需要２个根据已知序列设计的引物，２个根据载体序列设计的引物，然后分别利用一条已知序列特异性引物和载体上非特异性引物进行ＰＣＲ扩增。其操作一般包括３轮ＰＣＲ扩增，第１轮采用不对称ＰＣＲ的方法，在扩增时使用两种引物浓度不同，一般高浓度引物与低浓度引物比为（５０￣１００）：１，在最初１０￣１５个循环的产物主要是双链ＤＮＡ，待低浓度引物耗尽后，继续由高浓度引物介导产生大量单链ＤＮＡ。第２轮中，把第１轮ＰＣＲ产物稀释后做模板，引物为相同浓度的特异性引物和非特异性引物，这一轮可得到双链ＤＮＡ。第３轮ＰＣＲ目的主要是检测所得ＰＣＲ产物是否为预期产物（流程如图１）。

王树启（２００３）用锚定ＰＣＲ克隆了胡萝卜ＡＦＰ（抗冻蛋白）基因上游序列。首先用３种限制性内切酶构建了３个胡萝卜基因组质粒文库，作为ＰＣＲ反应的模板。在一次ＰＣＲ中无特异带出现，在二次ＰＣＲ中以ＨｉｎｄⅢ构建的质粒文库出现了特异带，将二次ＰＣＲ的不同方向的两条特异引物克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体中，分别命名为ｐＢＴ７ｐ和ｐＢＴ３Ｐ，对这２个重组

８６