植物基因启动子的克隆方法及其应用

分子植物育种，２００６年，第４卷，第３（Ｓ）期，第８５－９１页
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３（Ｓ），８５－９１
专题报告
Ｒｅｖｉｅｗ
植物基因启动子的克隆方法及其应用
尹辉李丹张毅李秋莉﹡
辽宁师范大学生命科学学院，大连，１１６０２９
﹡通讯作者，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ
摘要植物基因的表达调控已成为分子生物学研究热点，启动子是基因表达调控的重要顺式元件，启动子的克隆对于研究基因表达调控、构建基因工程载体、表达目的蛋白有着重要的意义。

启动子克隆的方法很多，从常用的启动子陷阱技术筛选启动子到ＰＣＲ方法的应用，此后相继问世的一些基于ＰＣＲ的克隆启动子技术，如载体锚定ＰＣＲ、反向ＰＣＲ、接头ＰＣＲ、交错热不对称ＰＣＲ等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法。

本文着重介绍了几种植物基因启动子的克隆方法，分析了它们的优缺点，并展望了今后的研究前景。

关键词启动子，启动子陷阱技术，反向ＰＣＲ，锚定ＰＣＲ，交错热不对称ＰＣＲ
ＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ＹｉｎＨｕｉＬｉＤａｎＺｈａｎｇＹｉＬｉＱｉｕｌｉ＊
ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬｉａｏｎｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ，１１６０２９
﹡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｌｉｑｉｕｌｉ＠ｄｌ．ｃｎ
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ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｒｏｍｏｔｅｒ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒｔｒａｐｐｉｎｇ，Ｉ－ＰＣＲ，ＡｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ
启动子是ＲＮＡ聚合酶能够识别并与之结合、从而起始基因转录的一段ＤＮＡ序列，是基因表达调控的重要元件。

启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。

植物基因启动子的克隆，对研究植物基因表达调控和构建表达载体至关重要。

本文就近几年来克隆植物基因启动子的各种方法做一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。

１植物基因启动子克隆的几种方法
１．１利用常规ＰＣＲ技术克隆启动子
对于序列已知的启动子，只需要根据已知的启动子序列设计引物，然后采用ＰＣＲ扩增的方法就可以获得该启动子。

该方法比较简便快捷，是近年来使用较为广泛的一种方法。

王利军等（２００４）根据ＧｅｎＢａｎｋ中拟南芥基因组序列中ａｔｓ１Ａ（核酮糖－１，５－二磷酸羧化酶小亚基）基因启动子的序列设计引物，以拟南芥总ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出ａｔｓ１Ａ的基因启动子区片段，将其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，得到重组质粒并且进行测序，序列分析表明，所克隆的片段为１１１７ｂｐ，与Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中的ａｔｓ１Ａ基因启动子序列比较，发现只在－７７６位缺失１个碱基。

该方法简便、快捷、操作简单，但不能克隆到全新的启动子。

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１．２通过构建及筛选基因组文库来克隆启动子该方法首先要提取基因组ＤＮＡ，用限制性内切酶消化，产生出适合于克隆的ＤＮＡ片段，然后在体外将这些ＤＮＡ片段同适当的λ噬菌体载体连接成重组体分子，并转化到大肠杆菌的受体细胞中，构建基因组文库。

将构建好的基因组文库铺板，转移到尼龙膜上，用部分已知序列的片段或特异的基因片段做探针进行杂交，筛选出具有目的启动子的克隆，测序分析即可获得该启动子。

Ｒｉｎｅｈａｒｔ等（１９９６）利用此方法，通过筛选海岛棉基因组文库，克隆了纤维发育中后期特异表达基因ＦｂＬ２Ａ的上游序列，它具有启动子的基本特征，包含了启动子所必须的ＴＡＴＡ框等结构。

Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ和Ｔｒｉｐｌｅｔｔ（１９９９）也用此方法获得了纤维发育次生壁增厚时期特异表达的长为２．６Ｋｂ的ＧｈＣｅｓＡ４启动子，通过与报告基因ＧＵＳ融合，转化棉花，结果发现在次生壁合成阶段，ＧＵＳ的表达显著增强，与纤维素的合成成正比关系。

此方法需要构建基因组文库，工作量大，但如果已知部分启动子序列，可以使用该方法。

１．３利用载体或染色体步行技术克隆基因启动子１．３．１启动子陷阱技术
利用启动子陷阱技术筛选启动子是一种常用的方法。

它是利用启动子缺失的报告基因构建启动子探针质粒，通过报告基因的表达来克隆有启动功能的ＤＮＡ片段。

在该技术中关键是要构建一种启动子探针载体。

这种载体系统应该满足这样的要求：（１）报告基因经启动子启动后，基因产物应便于鉴定，方便筛选；（２）报告基因经启动子启动后，基因产物应易于量化，最好是某种酶；（３）除了带有通常的抗生素抗性基因以外，载体上还应有第二个选择标记；（４）紧靠着报告基因的上游应有数个克隆位点；（５）质粒稳定存在，拷贝数已知。

利用启动子陷阱技术筛选启动子的过程为：先选用一种适当的核酸内切限制酶消化切割染色体ＤＮＡ；接着将切割产生的ＤＮＡ限制片段群体与无启动子的质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；然后再把重组混合物转化寄主细胞，构成质粒载体基因文库，检测报告基因的表达活性，报告基因若具有活性，则其上游的ＤＮＡ片段即具有启动子活性。

张晓宁（２００２）用启动子探针载体ｐＥＣＥ７克隆了盐藻耐盐基因的启动子。

ｐＥＣＥ７具有完整的新霉素抗性基因转录单元和氯霉素抗性（氯霉素乙酰转移酶）基因，可在大肠杆菌中正常复制，但缺少表达氯霉素乙酰转移酶基因所需的启动子序列。

该基因含有自身的核糖体结合位点，其５’端有一个ＥｃｏＲⅠ克隆位点，供外源ＤＮＡ片段插入。

如果插入的外源ＤＮＡ片段具有启动子活性，该基因即可表达，含有此质粒的细菌就可以在含有氯霉素的抗性平板上正常生长。

他们用ＥｃｏＲⅠ酶切盐藻基因组的ＤＮＡ，再与用ＥｃｏＲⅠ酶切后的ｐＥＣＥ７相链，转化大肠杆菌，从新霉素和氯霉素抗性平板上筛选重组子，得到一个双抗重组子。

为了保证转化的抗性表现确实来自于盐藻启动子的作用，提取重组子的质粒，重新转化大肠杆菌，用氯霉素筛选，同样得到转化子。

经酶切和电泳分析，证明重组质粒与原来的ｐＥＣＥ７大小和结构均一致，从而证明大肠杆菌的氯霉素抗性确实来自外源质粒的氯霉素抗性基因的活性表达，也证明插入的片段在盐藻中具有启动基因表达的功能。

此方法的优点是不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了设计引物，并可获得大量的未知序列启动子片段。

１．３．２锚定ＰＣＲ技术
锚定ＰＣＲ（ａｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲ）是由Ｈｕａｎｇ等（１９９３）提出的扩增已知序列侧翼未知片段的方法。

反应中需要２个根据已知序列设计的引物，２个根据载体序列设计的引物，然后分别利用一条已知序列特异性引物和载体上非特异性引物进行ＰＣＲ扩增。

其操作一般包括３轮ＰＣＲ扩增，第１轮采用不对称ＰＣＲ的方法，在扩增时使用两种引物浓度不同，一般高浓度引物与低浓度引物比为（５０￣１００）：１，在最初１０￣１５个循环的产物主要是双链ＤＮＡ，待低浓度引物耗尽后，继续由高浓度引物介导产生大量单链ＤＮＡ。

第２轮中，把第１轮ＰＣＲ产物稀释后做模板，引物为相同浓度的特异性引物和非特异性引物，这一轮可得到双链ＤＮＡ。

第３轮ＰＣＲ目的主要是检测所得ＰＣＲ产物是否为预期产物（流程如图１）。

王树启（２００３）用锚定ＰＣＲ克隆了胡萝卜ＡＦＰ（抗冻蛋白）基因上游序列。

首先用３种限制性内切酶构建了３个胡萝卜基因组质粒文库，作为ＰＣＲ反应的模板。

在一次ＰＣＲ中无特异带出现，在二次ＰＣＲ中以ＨｉｎｄⅢ构建的质粒文库出现了特异带，将二次ＰＣＲ的不同方向的两条特异引物克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体中，分别命名为ｐＢＴ７ｐ和ｐＢＴ３Ｐ，对这２个重组
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质粒进行测序分析，结果表明这两个克隆的核心序列完全一致，同ＧｅｎＢａｎｋ中的胡萝卜基因序列比较，证实这个克隆的确是ＡＦＰ基因上游的序列。

此方法需要知道启动子相邻序列，且要构建基因组文库。

１．３．３反向ＰＣＲ技术
反向ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲ，简称Ｉ－ＰＣＲ）是由Ｔｒｉｇｌｉａ等（１９８８）在常规ＰＣＲ基础上提出的扩增位于靶ＤＮＡ区段之外的两侧未知序列的方法。

其基本操作程序如图２：（１）提取ＤＮＡ，用适宜的限制性内切酶进行切割（黑框部分表示已知序列）；（２）用连接酶将酶切片段进行自身连接，形成一环状结构，从而使引物处于一个相对的位置；（３）先用嵌套引物的内引物ｂ和ｃ进行首轮ＰＣＲ，然后以其ＰＣＲ产物为模板利用外引物ａ和ｄ进行第２轮ＰＣＲ，增加ＰＣＲ产物的特异性和成功率；（４）第２轮ＰＣＲ产物纯化后可直接进行序列分析或克隆后再进行序列分析。

Ｆｏｒｅｓｔｅｒ等（１９９４）用该方法克隆了豌豆种子脂肪加氧酶基因启动子约８００ｂｐ片段。

韩志勇等（２００１）以Ｉ－ＰＣＲ技术为基础克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序列。

首先用限制性内切酶切割转基因水稻的总ＤＮＡ，酶切片段进行自身连接，然后根据质粒的Ｔ－ＤＮＡ区设计２对反向引物，进行套式ＰＣＲ扩增旁侧序列。

在一周内克隆了３５个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在３００￣７５０ｂｐ之间。

Ｉ－ＰＣＲ法快速、高效、稳定，操作相对简单，花费少，ＰＣＲ引物设计比较方便。

植物基因启动子的克隆方法及其应用
ＣｌｏｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅＰｒｏｍｏｔｅｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
图１锚定ＰＣＲ的流程图
Ｆｉｇｕｒｅ１ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆａｎｃｈｏｒｅｄＰＣＲｍｅｔｈｏｄ
图２Ｉ－ＰＣＲ的流程图
Ｆｉｇｕｒｅ２ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＩ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ
１．３．４接头ＰＣＲ技术
接头ＰＣＲ是继Ｉ－ＰＣＲ方法之后的又一用来扩
增基因组中已知序列两侧未知序列的方法。

当基因
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序列已知，要克隆此基因启动子时即可使用此方法。

其原理如下：首先，用几种限制性内切酶酶切ＤＮＡ，然后将酶切后的ＤＮＡ与体外合成的接头在适当的条件下连接，取适量连接产物直接作为ＰＣＲ模板，其中一条引物为接头特异引物，其序列能与接头序列互补，另一条引物为基因特异引物，其序列与已知序列互补，该引物３＇端朝向要扩增的序列区。

最后将ＰＣＲ产物克隆并测序。

杨予涛等（２００３）用限制性内切酶酶切牵牛基因组ＤＮＡ，然后将酶切产物与设计的相应的接头连接，以此为模板，分别进行接头ＰＣＲ反应。

最终成功地克隆了一个光合组织特异表达的启动子。

在这种方法中，有一个特殊的接头，该接头由一条长链和短链组成，短链接头的３＇端有一个ＮＨ
２
的存在，它能阻断短接头链的酶促延伸，而且只有当一条远端的基因特异引物相对长链接头方向延伸一条ＤＮＡ链后，才能产生引物结合位点。

如果产生了两末端都含有双链接头序列的ＰＣＲ产物（非特异性ＰＣＲ产物），由于反向重复序列的存在，在紧接着的每步变性过程中ＤＮＡ链的末端会形成发夹结构。

这些结构比引物与模板的杂交链更稳定，因此会抑制指数式扩增。

然后，当一个远端的基因特异性引物通过接头延伸一条ＤＮＡ链，延伸产物将只有一端会有接头序列，这样就不能形成发夹结构，ＰＣＲ扩增能正
常进行。

王新国等（２００１）就是利用这种特殊的接头，设计了位于单链ＤＮＡ两端互补的颠倒末端重复序列，一条长链接头序列和一条短链接头序列。

增加了反应的特异性，在胡萝卜Ⅱ型转化酶基因启动子的克隆方面取得了新的进展。

根据接头ＰＣＲ的原理，ＴａＫａＲａ公司推出了ＬＡ－ＰＣＲ体外克隆试剂盒（ＤＤＲ０１５）。

用来克隆基因侧翼未知序列，其流程如图３。

苗红梅（２００４）用此试剂盒克隆了小麦淀粉合成酶基因ｇｂｓｓ（ｇｒａｎｕｌｅ－ｂｏｕｎｄｓｔａｒｃｈｓｙｎｔｈａｓｅ）的启动子序列。

对小麦的总ＤＮＡ进行酶切，然后与相应的ｃａｓｓｅｔｔｅ（盒）连接作为模板，由试剂盒提供的２个引物及２个根据已知序列设计的引物进行ＰＣＲ扩增。

ＰＣＲ产物克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化大肠杆菌，提取质粒后测序。

结果发现，该段序列与ＧｅｎＢａｎｋ中报道的ｇｂｓｓ启动子序列相似率为９９％，可以认定该序列是ｇｂｓｓ启动子的序列。

Ｌｉ等（２００５）也用ＬＡ－ＰＣＲ试剂盒，首次分离了长度为１２１６ｂｐ的山葡萄几丁质酶基因ＶＣＨ３上游启动子序列。

１．３．５交错式热不对称ＰＣＲ
交错式热不对称ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｉｎｔｅｒ－ｌａｃｅｄＰＣＲ，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ），是由Ｌｉｕ等提出的（ＬｉｕａｎｄＷｈｉｔｔｉｅｒ，１９９５；Ｌｉｕｅｔａｌ．，１９９５）。

ＴＡＩＬ－ＰＣＲ技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计３个嵌套的特异引物（ｓｐｅｃｉａｌｐｒｉｍｅｒ，ｓｐ１，ｓｐ２，ｓｐ３），每个约２０ｂｐ，用它们分别和１个具有低Ｔｍ值的短的（１４ｂｐ）随机简并引物（ａｒｂｉｔｒａｒｙｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒ，ＡＤ）相结合，以基因组ＤＮＡ作为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异产物，流程如图４（罗丽娟和施季森，２００３）。

ＴＡＩＬ－ＰＣＲ共分３轮反应，第１轮ＰＣＲ反应由５次高特异性反应，１次低特异性反应，１０次较低特异性反应和１２次热不对称的超级循环构成。

５次特异性反应，使ｓｐ１与已知序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；１次低特异性反应使简并引物结合到较多的目标序列上；１０次较低特异性反应使２种引物均与模板退火，随后进行１２次超级循环。

上述反应得到了不同浓度的３种类型产物：特异性产物（Ⅰ型）和非特异性产物（Ⅱ型和Ⅲ型）。

第２次反应则将第１次反应的产物稀释１０００倍作为模板，通过１０次热图３ＬＡ－ＰＣＲ流程示意图
注：１：选择适当限制内切酶切割ｇＤＮＡ（灰色片段代表已知片段）；２：ｇＤＮＡ片段与相应Ｃａｓｓｅｔｔｅ（黑色）连接；３：根据已知序列设计引物Ａ１，Ａ２并与Ｃ１，Ｃ２进行ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ；４：电泳观测结果；５：回收产物并进行测序
Ｆｉｇｕｒｅ３ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＬＡ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ
Ｎｏｔｅ：１：ＳｅｌｅｃｔｉｎｇｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｔｏｄｉｇｅｓｔｇＤＮＡ（ｇｒａｙｓｈｏｗｅｄｔｈｅｋｎｏｗｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）；２：ｇＤＮＡｌｉｎｋｉｎｇｗｉｔｈＣａｓｓｅｔｔｅ（ｂｌａｃｋ）；３：ＤｅｓｉｇｎｉｎｇｔｈｅｐｒｉｍｅｒａｃｃｏｒｄｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅｋｎｏｗｎｓｅｑｕｅｎｃｅＡ１，Ａ２ａｎｄｎｅｓｔＰＣＲｗｉｔｈＣ１，Ｃ２；４：ＡｇａｒｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｎｇｔｈｅＰＣＲｒｅｓｕｌｔ；５：Ｐｕｒｉｃｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
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图４ＴＡＩＬ－ＰＣＲ流程示意图
Ｆｉｇｕｒｅ４ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＴＡＩＬ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ
不对称的超级循环使特异性的产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。

第３次反应又将第２次反应的产物稀释作为模板，再设置普通的ＰＣＲ反应或热不对称超级循环，通过上述３次ＰＣＲ反应可获得与已知序列邻近的目标序列。

刘召华等（２００５）根据尾穗苋凝集素ＡＣＡ（Ａｍａ－ｒａｎｔｈｕｓｃａｕｄａｔｕｓａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）基因５’端已知序列设计３个基因特异的反向引物，分别与１１个简并引物配
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对，进行交错式热不对称ＰＣＲ扩增，获得了ＡＣＡ基因起始密码子上游约７００ｂｐ的片段，为了检测其表达特征，构建了该片段与ＧＵＳ嵌合基因的表达载体，通过农杆菌介导转化植物，ＧＵＳ染色结果显示，该ＤＮＡ片段具有种子特异表达的启动子活性。

Ｗａｎｇ等（２００４）用ＴＡＩＬ－ＰＣＲ法分离了小球藻硝酸还原酶基因５＇端侧翼序列，将其与ＧＵＳ基因融合并表达，结果显示该侧翼序列能启动ＧＵＳ基因的表达，该片段含有硝酸还原酶基因转录表达所必要的启动子元件。

财音青格乐等（２００５）通过此方法，成功地克隆了大豆种子特异性启动子序列（约７００ｂｐ）。

李秋莉等（２００６）也应用ＴＡＩＬ－ＰＣＲ法成功地克隆了辽宁碱蓬ＢＡＤＨ基因的启动子片段。

根据Ｌｉｕ和Ｈｕａｎｇ（１９９８）报道，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ方法通常可以扩增到０．２￣２Ｋｂ的片段。

所以，ＴＡＩＬ－ＰＣＲ法是用于未知启动子克隆的一种有效、简便的方法。

２植物基因启动子克隆方法的特点及应用
以上介绍了几种基本的克隆植物基因启动子的方法，各种方法有其各自的特点和使用的范围。

ＰＣＲ法主要优点是简便、快捷、操作简单，其缺点是不能克隆到全新的启动子片段，只有在已知该启动子的序列时，才能选用此方法。

利用构建文库来筛选启动子的方法，需已知部分序列，且工作量很大，资金的投入也较多，所以一般不采用这种方法。

但如果已知启动子的部分序列，想获得更多序列可使用该方法。

利用启动子陷阱技术克隆启动子，不需要知道具体的基因序列，避免了设计引物，并能获得大量的启动子片段。

其缺点是需要构建一个穿梭载体，建库、转化、筛选，工作量较大，费时费力。

但它可以克隆到全新的启动子片段，如果对要克隆的启动子一无所知，可以选择该方法。

锚定ＰＣＲ技术具有简便、安全和快速的优点，而且还具有ＤＮＡ用量少、敏感及重复稳定性好等特点。

但其实验操作烦琐，特异性差。

如果已知基因的序列，又知载体的序列，要克隆其启动子片段，可选择此方法。

Ｉ－ＰＣＲ法快速、高效、稳定、操作简单，大大减少了工作量。

但它的不足是需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适酶进行酶切才能得到合理大小的ＤＮＡ片段。

在实验中还增加了ＤＮＡ环化过程，在环化连接过程中常常产生多联体，成为副产物甚至是主要产物，导致非特异扩增。

该法适用于寻找只有一端序列已知的ＤＮＡ。

接头ＰＣＲ方法避免了ＤＮＡ环化，但添加特殊的接头也增加了实验的成本。

用常规的接头方法来克隆启动子时往往有非特异产物产生，特异性较低，ＰＣＲ产物需要杂交确定。

该方法通常适用于寻找已知ｃＤ－ＮＡ周围未知启动子序列。

ＴＡＩＬ－ＰＣＲ是利用最广泛的一种扩增基因侧翼序列的方法，它有很多优点：（１）简单。

对模板ＤＮＡ不需要进行预处理，在ＰＣＲ结束后也不需要进行费力的展示，而其它方法在ＰＣＲ前需要大量的预处理（如酶切，连接，加尾）或在ＰＣＲ后进行处理（杂交，延伸，胶回收）。

对模板的数量和质量的要求也是非常低的；（２）高特异性。

ＰＣＲ后的产物可以直接用作测序或杂交探针；（３）高效，高灵敏性，快速，不需要进行连接反应。

尽管ＴＡＩＬ－ＰＣＲ有很多优于其它克隆方法的优点，但仍存在一些问题，由于随机简并引物存在有限的结合位点，对个别侧翼序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果，但相信随着该技术的不断发展，必将能够克服各种缺陷。

３展望
启动子的克隆方法很多，大多数方法都是建立在ＰＣＲ基础上的染色体步行技术，但也有用Ｔ－ＤＮＡ标签法来克隆植物基因启动子的。

随着基因工程的发展，出现了很多克隆动物基因启动子、菌类基因启动子的方法，如果这些方法用来克隆植物基因启动子，那么将会大大扩展植物基因工程的发展空间，更能有效的利用启动子来调控植物的生长发育和生命周期。

随着科学技术的不断进步，相信一定也会出现更多、更好的克隆植物基因启动子的方法。

致谢
本项目由国家自然科学基金（３０３７０８０６），辽宁省科技基金（２００３１０６０），辽宁省教育厅项目（２００４Ｆ０９１）资助。

参考文献
Ｃａｉ－ＹｉｎＱ．Ｇ．Ｌ．，ＬｉＭ．Ｃ．，ＣａｉＹ．，ＴａｏＲ．，ａｎｄＸｉｎｇＬ．Ｊ．，２００５，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅｅｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏ－ｍｏｔｅｒｆｒｏｍｓｏｙｂｅａｎ，ＺｕｏｗｕＸｕｅｂａｏ（ＡｃｔａＡｇｒｏｎｏｍｉｃａＳｉｎｉｃａ），３１（１）：１１－１７（财音青格乐，李明春，蔡易，陶然，邢来君，２００５，大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析，作物学报，３１（１）：１１－１７）
ＦｏｒｅｓｔｅｒＣ．，ＡｒｔｈｕｒＥ．，ＣｒｅｓｐｉＳ．，ＨｏｂｂｓＳ．Ｌ．，ＭｕｌｌｉｎｅａｕｘＰ．，ａｎｄＣａｓｅｙＲ．，１９９４，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｐｅａ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ）ｓｅｅｄｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｐｒｏｍｏｔｅｒｂｙｉｎｖｅｒｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ，
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