第十一章 高效液相色谱法

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高效液相色谱法

高效液相色谱法

高效液相色谱法Document number:WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT高效液相色谱法1简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离侧定的色谱方法。

注人的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进人检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪,由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成,仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。

色谱柱内径一般为~μm,填充剂粒径为3~10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径(约2μm)填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。

1.1.1色谱柱反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等;常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱:用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱:用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度,填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量,填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能,应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果,品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温,应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度,但一般不宜超过60℃。

最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。

反相色谱系统使用非极性填充剂,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。

《仪器分析》高效液相色谱法

《仪器分析》高效液相色谱法

《仪器分析》高效液相色谱法仪器分析是化学分析中的重要分支,是利用各种仪器设备对样品进行分析、测定和监控的科学方法。

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)作为仪器分析中的一种常用方法,具有快速、高效、灵敏度高等特点,在许多领域得到广泛应用。

高效液相色谱法是基于液相色谱原理发展起来的一种方法,其主要原理是利用色谱柱对样品中的化合物进行分离,再通过检测器对各个化合物进行定量测定。

高效液相色谱法相比传统的液相色谱法,具有流动相流速快、柱温控制稳定、色谱柱填充剂的粒径更小等优点,从而使样品得到更高的分离效果和更好的分辨率。

高效液相色谱法可以应用于多种不同类型的样品分析,例如药物分析、环境分析、食品安全监测等。

以药物分析为例,在药物研发和质量控制中,高效液相色谱法可以用于分析药物的纯度、含量和杂质等指标,从而保证药品的质量和安全性。

而在环境分析方面,高效液相色谱法可以用于检测水、土壤和空气中的有机污染物,为环境保护提供科学依据。

此外,高效液相色谱法还可以用于食品安全监测,检测食品中的农药残留和添加剂等有害物质,保障人民群众的身体健康。

高效液相色谱法的操作相对简单,但是在实际应用中也需要注意一些技巧和注意事项。

首先,需要选择合适的色谱柱和填充剂。

不同的分析目标和样品类型需要选择不同的色谱柱和填充剂,以获得最佳的分离效果和分辨率。

其次,需要合理选择流动相的组成和流速。

流动相的组成和流速会直接影响样品的分离效果和检测结果,因此需要经过调试和优化。

最后,还需要进行准确的定量分析。

在高效液相色谱法中,常用的定量方法包括外标法、内标法和标准曲线法等,可以根据实际情况选择合适的方法进行定量分析。

综上所述,高效液相色谱法是一种快速、高效、灵敏度高的仪器分析方法,具有广泛的应用领域和潜力。

在实际应用中,需要根据具体的分析目标和样品类型选择合适的色谱柱和填充剂,合理选择流动相的组成和流速,并进行准确的定量分析。

第十一章 色谱法

第十一章 色谱法

内标法
计算公式 : mi
Ai f i ' ms As f s '
Ai f i ' mi ms As f s '
mi Ai f i 'ms Ai Ci % 100% 100% 常数 m总 As f s 'm总 As
Ai/As
Wi
内标法标准曲线
内标物的选择:
r21 =
t t
' R2 ' R1
=
V
V
' R2 ' R1
r21 同种固定液对难分离物质对的选择性度量 r21 越大,两组分分离越容易 在气相色谱中, r21的大小仅与固定相种类和 柱温有关。在液相色谱中, r21与固定相、流 动相及柱温有关。 r21是色谱定性的重要参数, 实验室之间可通用。
§2、色谱法基本理论
评价 :简单,准确。
不适用于试样中组分不能全部出峰的情况。
§2、色谱法基本理论 适用条件: 用于测定试样中个别组分 具体方法:选用一定量的纯物质作内标, 固定内标物和样
品的取样量, 配制一系列具有相同浓度内标物和不同浓度待测 组份纯物质的一系列溶液进行测定, 以Wi(已知的待测组份含量) 对Ai/As (待测物质与内标物的峰面积之比)作图:
(2) 基线 只有流动相经过检测器时,所产生的信号, 反映实验条件的稳定情况。稳定时为直线。
tR 进 样 tM 空 气 峰 tR’
2. 关于保留值的术语 (1) 用时间表示的保留值 tR保留时间:进样柱后出现Cmax值时所需时间 tM死时间: 不与固定相作用的组分的保留时间
t R 调整保留时间:
改变柱温也可改变r21。
§2、色谱法基本理论 三、色谱定性定量方法 1. 定性分析

中国药典版高效液相色谱法课件

中国药典版高效液相色谱法课件

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3.甲醇和乙睛的截止波长是多少, 应用 意义是什么
甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右,在流动相中,增大甲醇和 乙睛的比例,即增加有机相的比例,能 使出峰面积加快,但同时减少分离度。
中国药典版高效液相色谱法
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二原理
高效液相色谱法是用高压输液泵将 具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装 有固定相的色谱柱,经进样阀注入供 试品,由流动相带入柱内,在柱内各 成分被分离后,依次进入检测器,色 谱信号由记录仪或积分仪记录。
中国药典版高效液相色谱法
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三 1.对仪器的一般要求
中国药典版高效液相色谱法
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(3)加校正因子的主成份自身对照法 (4)不加校正因子的主成份自身对照法
中国药典版高效液相色谱法
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(5)面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大, 因此本法 只能通常用于粗略考察供試 品中的杂质含量,除另有规定外,一 般不宜用于微量杂质的检查,方法是 测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂 外的总色谱 峰面积,计算各峰面积及 其之和占总峰面积的百分率。
(11)紧固件或连接件泄漏-------------(11) 拧紧或更换紧固件
(12)进样装置部分堵塞----------------(12) 检修进样器并清洗
中国药典版高效液相色谱法
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现象5:峰重现性差
判断————————————--------------排除方法
(1)注射器针头太长,样品液部分漏掉 ------(1)选用合适的针头
高效液相色谱法
一概述 高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术,随着不断改进与发展,目前已成为应用 极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上,引入了气相色谱的 理论,在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器,因而具备速度快、效率 高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性,现从两方 面进行比较:

高效液相色谱法

高效液相色谱法

高效液相色谱法一、原理高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相,压入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品,由流动相带入柱内,在柱内各成分被分离后,依次进入检测器,色谱信号由记录仪或积分仪记录。

二、适用范围高效液相色谱法是一种分离分析方法,适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。

中国药典主要用于药品的含量测定、有关物质检查、杂质限度检查和鉴别等。

三、仪器高效液相色谱仪主要由输液泵系统、进样器系统、色谱柱、检测器、记录器、显示器及数据处理机(或兼有组分收集系统)等组成。

使用时应按仪器的说明书进行操作。

四、仪器的校正1.高效液相色谱仪的柱箱控温精度、基线噪声、基线漂移、灵敏度或检测限、线性范围的检定均按仪器说明书的技术要求进行校验,应符合规定。

2.以紫外-可见光检测器、荧光检测器、差示折光检测器为检测器的实验室通用液相色谱仪的检定,所用各种标准物质应使用经国家技术监督部门批准颁发的标准物质。

具体校正方法和主要技术指标见“高效液相色谱仪检测器的校验”。

3.泵的耐压试验4.泵流量设定值误差、流量稳定性误差的试验5.柱恒温箱温度设定值误差和控温稳定性误差的试验6.梯度准确度的试验7.定性定量重现性的试验五、对仪器的一般要求1.色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。

常用的色谱柱填充剂有硅胶(正相色谱)和化学键合硅胶,后者以十八烷基硅烷键合硅胶(反相色谱)最为常用,辛基硅烷键合硅胶次之,氰基或氨基键合硅胶也有使用。

离子交换填充剂用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。

除另有规定外,柱温为室温,检测器为紫外吸收检测器。

2.药典正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。

生物化学与分子生物学-第十一章第三节 双酚类

生物化学与分子生物学-第十一章第三节 双酚类
沸点350~400℃,熔点160~163℃,白色粉末 状或晶体,易溶于乙醇,乙醚,甲苯等,微溶 于四氯化碳,难溶于水,可溶于碱水溶液, 加热到510℃可分解燃烧。
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三、双酚A代谢和生物监测指标 • 用途:食品包装、奶瓶、水瓶、牙齿填充
物所用的密封胶、眼镜片等数百种日用品 的制造过程。 • 接触来源:
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五、尿中双酚A的测定
超高效液相色谱-串联质谱法: • 色谱条件同尿样中烷基酚测定。 • 质谱条件:碰撞能量为22eV,监测离子为双酚
A母离子m/z227.2,子离子m/z212.2,m/z211.2 高效液相色谱法-荧光法:同尿样中烷基酚测定
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BPA:双酚A NP:壬基酚 OP:辛基酚
二氯甲烷-甲醇( 90+ 10)溶液洗脱SPE柱:NP 和OP 的极性较低,BPA 的极性相对较高,单纯使用甲醇 或二氯甲烷无法同时洗脱三种目标化合物
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六、血清中双酚A的测定
高效液相色谱-串联质谱法: 气相色谱-质谱法
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(一)高效液相色谱法
1. 原理
• 尿样在酸性环境下,加正己烷超声波提取,去 除部分干扰物,以甲醇-水梯度洗脱,C18柱分离, 荧光检测器检测,保留时间定性,峰高或峰面 积定量。
血清中的双酚A经有机溶剂萃取,氮气吹干, 加内标物13C12-双酚A,用硅烷化试剂衍生后进 行GC-MS法分析,内标工作曲线法定量。
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2.样品处理
• 萃取:血清→ 加6mol/LHCl振荡混匀→ 加乙醚, 剧烈振摇,静置后分层,取有机层→ 乙醚再萃取 两次,合并有机相,用饱和NaCl溶液洗涤

经典液相色谱法

经典液相色谱法
4.洗脱顺序
色谱柱一定,Ka大,即极性越强的组分吸附力越强→→→
柱色谱:tR越长→洗脱慢;反之Ka小,极性越弱组分先被洗脱。 平面色谱:Rf越小→展开慢;反之Ka小,极性越弱组分展开快。
❖ 附:常见化合物极性
❖ ①见登山图1

②双键↑,吸附力↑
羧酸 酚

③分子内氢键,吸附力↓
醇 酰胺
胺类
酮 酯 二甲胺
1. 被测组分性质(极性大小): 烃< - - - - - - - - <羧酸
2. 吸附剂的活性: 吸附剂的活性↑大,对组分的吸附能力↑强,K ↑大 强极性物质——选择弱吸附剂 弱极性物质——选择强吸附剂
3. 流动相的极性: 流动相极性↑大,对组分的展开能力↑大 , K ↑小 “相似相溶”原则 :根据组分性质、吸附剂的活性, 选择适当极性的流动相
✓ 分离对象:大分子量(>2000)的化合物 有机聚合物(如 聚烯烃、聚苯乙烯和聚酰胺等) 生物大分子(如蛋白质、核酸、低聚糖、肽类等)
局限: ✓ 不能分离大小相近的化合物 ✓ 为得到良好的分离,组分的分子量应相差10%以上。
应用
✓ Kp∝尺寸∝相对分子质量——
可应用于高分子分子量的测定
➢ 结论:
分 类:
平面色谱
薄层色谱 (TLC) 纸色谱 (PC)
吸附薄层色谱 分配薄层色谱 分子排阻薄层色谱
薄层电泳法
一、平面色谱参数
(一)定性参数
1、比移值(Rf)
Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 LL0离
Rf=0: 组分在原点,完全被固定相保留
L
0
Rf=1: 组分在前沿,完全不被固定相保留
适用:分析酸性或中性物质 ,如有机酸、氨基酸、甾体等 选择性保留碱性物质,如胺类

高效液相色谱方法及应用课件

高效液相色谱方法及应用课件

七、高分子材料的分析
高分子工业材料及生物高分子分析是近年 来新兴的课题。凝胶色谱是分离分析高分子组 成及鉴定其性能的最好方法。高分子材料中填 充各种助剂、乳化剂、分散剂等物的分离,色 谱技术也独具特点。
①控制高分子产品质量 在生产工艺中,可 利用凝胶色谱测定聚合物小分子杂质。如用 凝胶色谱测定环氧树脂中未聚合的双酚A,用 C18柱分离小分子环氧化合物,小分子聚苯乙 烯或不能成膜的聚脂等,用以鉴定聚合物的 质量。 ②测定聚合物的分子量分布宽度 分子量大 小和分子量分布宽度是衡量聚合物质量的一 种重要指标,用凝胶色谱可以测定。
高效液相色谱法的特点
• 一、与经典液相色谱法比较 经典液相(柱)色谱法使用粗粒多孔固定相,装 填在大口径、长玻璃柱管内,流动相仅靠重力流经 色谱柱,溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢,柱 入口压力低,仅有低柱效,分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相,装填 在小口径、短不锈钢柱内,流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱,溶质在固定相的传质,扩散 速度大大加快,从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
⑤糖的分析。糖的分析是其它方法较难完成 的。如把糖与硼酸缓冲液预选混合,使生成 糖-硼酸络合离子,再进行分离。可把蔗乳糖、 阿芦糖、果糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖、 山梨糖、木糖、葡萄糖等几十种,全部分开。 也可用胺基柱分离各种天然产物中伯糖的各 绷分。
三、天然产物中主要组分的分析
天然物的组分非常复杂,如中草药中各组 分含量多少对药剂作用影响很大。用此技术分 离分析,具有简便、快速的特点。氨基柱能分 离分析天然物中糖的组分。氰基柱能分离中药 紫草及其衍生物的组成。C18柱分离丹参中主 要组分儿茶酚、桂皮中桂皮酸、烟草中的酚类 化合物、麦角或鸦片中各种植物碱,这些都是 近来日益受到重视的结果。

仪器分析高效液相色谱法

仪器分析高效液相色谱法

仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,简称HPLC)是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。

它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用,使样品组分在柱子中发生分离,再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。

仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。

流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中,进样器将样品注入柱子中,柱子根据物理化学性质的差异,使不同组分发生分离,之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度,并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。

高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。

与传统的液相色谱法相比,高效液相色谱法的流动相的流速更高,柱子填充物颗粒更小,从而大大提高了分离效率。

同时,高效液相色谱法对样品的需求量较小,具有较好的分析灵敏度。

因此,高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。

在生物领域中,高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。

通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器,可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。

例如,对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态,对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。

在环境领域中,高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。

通过连接各种不同相的柱子,可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离,使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。

在食品领域中,高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。

通过选择合适的柱子和检测器,可以对复杂的食品样品进行分离和检测,以保证食品的安全性和质量。

在药物领域中,高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。

高效液相色谱法PPT课件

高效液相色谱法PPT课件
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开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
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正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相);流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷), 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。
3、关上排液(或灌注)旋钮,逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
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进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式(头)过滤器
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仪器:手动进样器-六通阀/定量环
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手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
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手动进样器
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仪器:检测器
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仪器:检测器-紫外
DAD检测器 流路
UV/Vis双灯,全波长检测
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色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的,色谱法(Chromatography)因之得 名。
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色谱法的分离原理是:
溶于流动相中的各组分经过固定相时, 由于与固定相发生作用(吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和)的大小、强 弱不同,在固定相中滞留时间不同, 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
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色谱分离过程
流动相 Temporal
course
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液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相,称为经典液相色谱法,此方法柱效 低、时间长(常有几个小时)。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上,于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。

高效液相色谱方法及应用课件

高效液相色谱方法及应用课件

未来发展趋势与展望
超高效液相色谱(UPLC)的普及与发展
随着色谱填料制造技术的进步,UPLC将逐渐成为主流技术,进一步提高分离效率和检 测灵敏度。
联用技术的发展
HPLC将与其他分析技术(如质谱、红外光谱等)更紧密地结合,实现多维、多组分的 同时分析,提高分析速度和准确性。
微纳流控芯片的集成与应用
随着微纳加工技术的发展,HPLC将与微纳流控芯片集成,实现样品制备、分离和检测 的一体化,为便携式、即时分析提供可能。
PART 06
高效液相色谱法的挑战与 展望
技术挑战与解决方案
01 02
分离效率的提高
随着样品组分的日益复杂,分离效率的提高成为HPLC技术面临的重要 挑战。解决方案包括开发新型填料、优化色谱柱参数以及采用先进的色 谱分离技术。
检测灵敏度的提高
对于痕量组分的分析,提高检测灵敏度是关键。解决方案包括采用高灵 敏度检测器、优化检测条件以及发展超高效液相色谱技术。
实验操作流程
流动相制备
根据实验要求,制备适量的流动 相,确保其比例、纯度和稳定性 符合要求。
样品处理
对样品进行预处理,如溶解、过 滤、稀释等,以便进行后续的液 相色谱分析。
柱子安装与条件优化
根据实验需求,选择合适的色谱 柱,并进行安装和条件优化,以 提高分离效果和实验效率。
进样与检测
将处理好的样品注入进样器,按 照设定的条件进行分离和检测, 记录数据。
发展历程与趋势
发展历程
HPLC技术自20世纪60年代问世以来, 经历了不断改进和完善的过程,已成 为一种成熟且广泛应用的分析方法。
发展趋势
随着科技的进步,HPLC技术正朝着 高分离度、高灵敏度、自动化和智能 化的方向发展,同时与其他分析技术 的联用也成为了研究热点。

第十一章高效液相色谱法教材

第十一章高效液相色谱法教材
➢ 高速:采用高压输液设备,流速大增加,分析速度极快。 只需数分钟; 而经典方法靠重力加料,完成一次分析需数 小时;
➢ 高效:柱填充物颗粒极细且规则,固定相涂渍均匀,传质 阻力小,因而柱效高,数分钟完成数百物质的分离;
➢ 高灵敏度:紫外检测器最小检测量 10-9g,荧光检测器灵
敏度可达10-11g。
操作条件:室温、高压。
11.3 HPLC的分类与基本原理
14.3.1高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC 液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
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一、液液分配色谱法(LLC) 二、液固吸附色谱法(LSC) 三、化学键合相色谱法(CBC) 四、离子对色谱法 五、离子色谱法
内梯度: 2台高压泵, 每台泵输送一种溶剂,配比由设定的程序控制。多种 溶剂混合前分别由泵增压入梯度混合室,混合后进入柱系统。
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3.进样系统
手动进样
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自动进样器进样
自动进样的样品量可连续调节,进样重复性 高,适合做大量样品分析。
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4. 分离系统——色谱柱
➢ 色谱柱是液相色谱的心脏部件,它包括柱管与固定相两部分。
激发波长(ex)和发射波长(em)的
选择;如菲、芘和苯并a芘的激发波长
:280、333 和365 nm;发射波长
350、390和410 nm
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11.6 高效液相色谱的应用
➢ 在食品研究中的分析应用
食品中的天然成分
✓ 碳水化合物
✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇
✓ 脂肪酸和有机酸

高效液相色谱法

高效液相色谱法

高效液相色谱法1 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离侧定的色谱方法。

注人的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进人检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪,由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成,仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。

色谱柱内径一般为3.9~4.6μm,填充剂粒径为3~10μm。

超高效液相色谱仪是适应小粒径(约2μm)填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度的高效液相色谱仪。

1.1.1色谱柱反相色谱柱:以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物符合硅胶和聚合物等;常见的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱:用硅胶填充剂,或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。

离子交换色谱柱:用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱:用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度,填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量,填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能,应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果,品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温,应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度,但一般不宜超过60℃。

最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。

反相色谱系统使用非极性填充剂,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氛基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。

正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。

色谱、液相色谱、高效液相色谱

色谱、液相色谱、高效液相色谱

薄荷油
第十三章
高效液相色谱法(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
特点:①高效:理论塔板数高达上万 ②高速:几分钟到几十分钟 ③灵敏度高:紫外、荧光、电化学 ④自动化:电脑化 与气相色谱比较:对试样的沸点没有特殊要求,可 用于分离难挥发的物质,如核酸、糖、蛋白质、多 肽等。可收集从柱子流出的组分。
色谱分离过程
色谱图(Chromatogram) 试样中各组分经色谱柱分离后,随流动相依次 流出色谱柱进入检测器,检测器的响应信号随 时间变化曲线或检测器的响应信号一流动相体 积曲线,称为色谱图。 *基线baseline —— 如果没有进样,只有流动 相在流动,得到的检测信号应是一条平稳的平 行于横坐标的直线,这条直线称为基线。 *色谱峰(Peak)—— 当试样中的组分经色谱 柱分离之后进入检测器时,得到的响应信号的 大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰 (Chromatographic peak)。
*该检测器可选择性(特异性)检测含N、P、S 的化合物。 灵敏度:10-13 ~10-14 g/N,S,P ④火焰光度检测器——含P,S等有机物的测定。 *在火焰中(富H2 ),R-SH 被还原为S,R-PO3-变 为HPO,并被激发到激发态,产生电磁发射,S 为394nm,HPO为526nm。灵敏度10-11~10-12 g ⑤光电离检测器( PID ) Photoionzation Detector
体积流量调整保留时间扣除死时间后的保留时间称为调整保留时间adjustretentiontime调整保留体积扣除死体积后的保留体积称为调整保留体积用v相对保留值在相同操作条件下组分与参比组分的调整保留值之比称为相对保留值relativeretention用r分配系数partitioncoeffcienr
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> SCN − > Cl − > HCOO − > CH 3COO − > OH − > F −
用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快
4.应用 .
离子型化合物、可离解的化合物、 离子型化合物、可离解的化合物、带电 荷的物质等 如无机盐、 荷的物质等。如无机盐、生物大分子氨基酸 、核酸、蛋白质等 核酸、
四、化学键合相色谱
二、进样系统
直接进样 进样阀 自动进样器
准备状态
进样状态
六通阀进样装置 六通阀进样装置 自动进样器
三、色谱柱
色谱仪心 脏
分离柱 内径: ~ 内径:1~6 mm,柱长:5~30 cm; ,柱长: ~ ; 柱填料粒径: 柱填料粒径:≤ 5µm
预柱(保护柱、前置柱) ◆ 预柱(保护柱、前置柱)
四、检测系统
一、吸附色谱法(液固吸附色谱LSC) 吸附色谱法(液固吸附色谱 ) 1.分离原理 .
X + nSad
吸附平衡常数
吸附竞争
Xad + n S
X:组分分子 : S:流动相分子 :
K ad
[ X ad ][ S ]n = n [ X ][ S ad ]
Kad值越大,保留时间越长 值越大,
2.固定相 .
硅胶- 硅胶-强极性 氧化铝- 氧化铝-弱极性
可用于梯度洗脱。 可用于梯度洗脱。
3.示差折光检测器(differentical refractive index detector) . )
二醇基 键合相
出峰顺序:甲苯, 出峰顺序:甲苯,苯酚
键合色谱柱、 例:以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离 键合色谱柱 甲醇以下两种苯甲酸,试判断出峰次序。 以下两种苯甲酸,试判断出峰次序。
保留时间: 保留时间:
HO
COOH
COOH
<
OH OH
OH OH
没食子酸
3,4-二羟基苯甲酸 二羟基苯甲酸
HPL C t分离:1 h
§11-2 基本理论
一、色谱柱柱效的基本关系式
neff tr ' t ' = 16 r = 5.54 W1 / 2 W
2 2
GC基本理论 基本理论 塔板、 (塔板、速 率)也适合 于LC
H eff
L = neff
二、分离度
2( t r 2 − t r 1 ) R= = (W1 + W2 ) neff 4 α −1 • α
(a) 固定波长紫外检测器
通用型 选择型
1.紫外吸收检测器(ultraviolet photometric detector) .紫外吸收检测器( (b) 可变波长紫外检测器
测 量 光 电 二 极 管 流 通 池 器 聚焦 氘灯190-600nm 氘灯
(c) 二极管阵列检测器
二极管
λ = 254 nm
分配色谱: 分配色谱:
液液色谱+ 液液色谱 键合色谱
采用化学键合相 的液相色谱
特点
固定相非常稳定,在使用中不易流失。 固定相非常稳定,在使用中不易流失。 稳定 由于可将各种极性的官能团键合到载体表面, 由于可将各种极性的官能团键合到载体表面, 因此它适用于种类繁多样品的分离。 适用于种类繁多样品的分离 因此它适用于种类繁多样品的分离。
3.流动相 .
水相缓冲液 有机改性剂 水相缓冲液+有机改性剂 缓冲液
(甲醇、乙醇和乙腈) 甲醇、乙醇和乙腈)
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值 值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序: 各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序:
2 2 2 − 柠檬酸离子 > SO4 − > C 2O4 − > I − > NO3 > CrO4 − > Br −
固定相: 流动相: 固定相 非极性 流动相 极性 组分极性: 二羟基苯甲酸<没食子酸 组分极性 3,4-二羟基苯甲酸 没食子酸 二羟基苯甲酸
尺寸排阻(凝胶 凝胶)色谱法 五、尺寸排阻 凝胶 色谱法SEC、GPC 、
1. 分离原理
(Size-Exclusion Chromatography) )
相对分子质量差别 大于10% 大于 %的化合物 才可以分离
液分配色谱LLC 二、分配色谱法(液-液分配色谱 液分配色谱 LLC分离原理 分离原理 + 键合相色谱) 键合相色谱)
Vm cs =k• K= Vs cm
K不仅与固定相的种类有关,也与流动相 不仅与固定相的种类有关,也与流动相 不仅与固定相的种类有关 的种类有关
固定相极性>流动相极性 固定相极性 流动相极性
溶剂 紫外截止 波长/nm 波长 CS2 氯仿 380 245 四氢 呋喃 212 苯 210 乙腈 甲醇 190
205

187
2.荧光检测器(fluorescencl detector) .荧光检测器(
灵敏度高, 灵敏度高,比UV高103倍 高 选择性好, 选择性好,
弧灯220-650nm 弧灯
等度洗脱与梯度洗脱
梯度洗脱的特点 梯度洗脱的特点
改善分离, 加快分析速度; 改善分离 加快分析速度; 改善峰形, 减少拖尾; 改善峰形 减少拖尾 可能引起基线漂移 可能引起基线漂移
梯度洗脱适用于: 梯度洗脱适用于:
分配比变化范围宽的复杂样品
3.贮液瓶及流动相 .
对流动相溶剂的一般要求
1) 对样品有一定的溶解度,以防在柱头产生沉淀。 对样品有一定的溶解度,以防在柱头产生沉淀。 2) 适用于所选择的检测器。 适用于所选择的检测器。 3) 化学惰性好,以免破坏固定相。 化学惰性好,以免破坏固定相。 4) 低粘度,增加样品的扩散系数,提高柱效。 低粘度,增加样品的扩散系数,提高柱效。 5) 纯度高,溶剂不纯会增加检测器噪声,产生伪峰。 纯度高,溶剂不纯会增加检测器噪声,产生伪峰。
修正的速率方程: 修正的速率方程:
H = A + Cu
提高柱效 途径
流动相流速对板高的影响
1) 小颗粒填料,填充均匀; 小颗粒填料,填充均匀; 2) 选择较低的流动相流速; 选择较低的流动相流速; 3) 选择粘度小的溶剂作流动相,改善传质。 选择粘度小的溶剂作流动相,改善传质。
§11-3 高效液相色谱分离方法

2.梯度洗脱装置 .
①改善分离 ②缩短分离时 间
泵增压 按比例
混合
内梯度) 高压梯度 (内梯度)
低压梯度(外梯度) 低压梯度(外梯度)
混合 泵输入
梯度洗脱
通过改变流动相的组成来调整组分 的k值,改变分离因子α值,以达到 最短时间内得到最佳分离的目的 内得到最佳分离的目的。 最短时间内得到最佳分离的目的。
第十一章
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
HPLC
主要内容
11-1 概述 11-2 基本理论 11-3 高效液相色谱分离方法 11-4 高效液相色谱仪 11-5 高效液相色谱应用 高效液相色谱应用
§11-1 概述
高效液相色谱法与经典液相色谱法
离子性键合相色谱
将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质 将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质 离子交换基团 表面上,就形成了离子性键合相色谱的固定相。 表面上,就形成了离子性键合相色谱的固定相。 其分离原理与离子交换色谱类同。 其分离原理与离子交换色谱类同。
甲苯和苯酚的分离。流动相:甲醇-水 例:甲苯和苯酚的分离。流动相:甲醇 水 十八烷基 键合相 出峰顺序:苯酚,甲苯 出峰顺序:苯酚,
组分极性越大, 组分极性越大, 保留时间越长
分离强极性物
正相分配色谱 正相分配色谱
固定相极性<流动相极性 固定相极性 流动相极性
组分极性越小, 组分极性越小, 保留时间越长
分离弱、 分离弱、非极性 物
反相分配色谱 反相分配色谱

离子交换色谱法( 三、离子交换色谱法(IEC) )
1.分离原理 .
阳离子交换
分离20种氨基酸 例:分离 种氨基酸 经典柱色 谱 柱长: 柱长:170 cm 柱径: 柱径:0.9 cm F:30 mL/h : t分离: >20 h 高效液相色谱仪 经典液相色谱 HPLC
经典液相柱 色谱装置
150-200 µm 3-10 µm 固定相粒径 流动相驱动方式 重力或低压泵 高压泵 很慢 快(1-10mL/min) 流动相流速
2. 键合相色谱法分类
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相: 常用固定相:C18 固定相 常用流动相 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙腈-水 乙腈 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
反相键合相色谱 疏溶剂分离机制
正相键合相色谱
固定相极性 > 流动相极性
M++ RSO3 H+
组分对交换 剂亲和力不 同
H+ + RSO3 M+
-
阳离子交换树脂
阴离子交换
RNR+ Cl- + X3 RNR3 X + Cl+ -
2.固定相 .
离子交换剂 基 质 合成树脂 纤维素 硅胶 阳离子: 阳离子: 强 -SO3H(强) -CO2H(弱) 弱 阴离子: 阴离子: 强 -N+R3(强) -NH2 (弱) 弱
★ 分离方法的选择
§11-4 高效液相色谱仪
Waters UPLC 超高效液相色谱仪
进样口 高压泵 色谱柱
检测器 流动相 溶剂 废液
高压输液系统 + 进样系统 + 分离系统 + 检测系统
一、高压输液系统 LC最重要的部 最重要的部
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