抗生素微生物测定法操作规程

抗生素微生物测定法操作规程1．目的：建立抗生素微生物测定操作规程，便于操作者正确进行抗生素效价测定。

2．适用范围：适用于抗生素的效价测定。

3．责任人：QC质量检验员4．正文：4.1 仪器设备与试液：4.1.1 仪器设备4.1.1.1 操作室：应在抗生素检定室中进行。

4.1.1.2 超净工作台：（用于菌种的接种或传代）4.1.1.3 恒温培养箱：隔板上可备有带孔的玻璃板并垫平。

4.1.1.4 电热鼓风干燥箱4.1.1.5 电热压力蒸汽灭菌器4.1.1.6 电热恒温水浴锅4.1.1.7 天平：分析天平，感量0.1mg4.1.1.8 游标卡尺：精度0.05mm，长度125mm。

4.1.1.9 双碟：为硬质玻璃培养平皿，内径90mm，高16～17mm，碟底厚薄均匀水平，无气泡。

4.1.1.10 陶瓦盖：内径约130mm，外径108mm，平坦，吸水性强。

4.1.1.11 钢管：内径（6.0±0.1）mm 或（7.8±0.1），高（10.0±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦，管壁厚薄一致。

4.1.1.12 钢管放置器：置于半无菌操作间内，应保持清洁，防止抗生素污染。

可定期按钢管放置器操作规程进行消毒。

4.1.1.13 毛细滴管：用玻璃管拉制，管口光滑。

4.1.1.14 称量瓶：25ml、50ml、100ml、200ml、250ml4.1.1.15 刻度吸管：1ml、2ml、5ml、10ml、20ml4.1.1.16 移液管2ml、5ml、10ml、20ml4.1.1.17 其他玻璃仪器4.1.2 试液：41.2.1 缓冲液、磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、磷酸盐缓冲液（pH 7.8）4.1.2.2 生理盐水4.1.2.3 0.1%新洁尔灭4.1.2.4 5%石炭酸4.1.2.5 75%乙醇溶液（配制酒精棉球用）4.1.2.6 3%煤酚皂溶液4.1.3 培养基：培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅵ4.1.4 试验用菌种：检定用标准菌种，由中国兽药监察所提供，为冷冻干燥菌种，其复苏、接种与保存均参照《菌种复苏操作规程》、《菌种接种操作规程》。

4.1.4.1 枯草芽孢杆菌（63501）4.1.4.2 短小芽孢杆菌（63202）4.1.4.3 藤黄微球菌（28001）4.2 试验前准备：4.2.1 试液配制：4.2.1.1 缓冲液：制备缓冲液的试剂应为分析纯。

4.2.1.1.1 磷酸盐缓冲液（pH 6.0）：取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，分装于500ml三角瓶中（分装时不宜超过容器的2/3），置于电热压力蒸汽灭菌器，经121℃蒸汽灭菌30分钟备用。

4.2.1.1.2 磷酸盐缓冲液（pH 7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。

分装于500ml三角瓶中（分装时不宜超过容器的2/3），置于电热压力蒸汽灭菌器，经121℃蒸汽灭菌30分钟备用。

4.2.1.2 灭菌生理盐水：取氯化钠9g，加水使成1000ml，滤过。

分装于500ml三角瓶中（分装时不宜超过容器的2/3），置于电热压力蒸汽灭菌器，经121℃蒸汽灭菌30分钟备用。

4.2.1.3 0.1%新洁尔灭：配制方法参照《微生物实验试剂制备操作规程》。

4.2.1.4 5%石炭酸：配制方法参照《微生物实验试剂制备操作规程》。

4.2.1.5 75%乙醇溶液：（配制酒精棉球用）：配制方法参照《微生物实验试剂制备操作规程》。

4.2.1.6 3%煤酚皂溶液：配制方法参照《微生物实验试剂制备操作规程》。

4.2.2 培养基的准备：4.2.2.1 培养基Ⅰ：参照《培养基制备操作规程》制备，分装于500ml三角瓶中（分装时不宜超过容器的2/3），置于电热压力蒸汽灭菌器，经121℃蒸汽灭菌30分钟备用。

4.2.2.2 培养基Ⅱ：参照《培养基制备操作规程》制备，分装于500ml三角瓶中（分装时不宜超过容器的2/3），置于电热压力蒸汽灭菌器，经121℃蒸汽灭菌30分钟备用。

4.2.2.3 培养基Ⅵ：参照《培养基制备操作规程》制备，分装于500ml三角瓶中（分装时不宜超过容器的2/3），置于电热压力蒸汽灭菌器，经121℃蒸汽灭菌30分钟备用。

4.2.3 菌悬液的制备：4.2.3.1 枯草芽孢杆菌（63501）悬液：取枯草芽孢杆菌工作用菌种普通斜面培养物加灭菌水1～2ml将菌苔洗下，制成悬液，用灭菌吸管将此悬液接种到盛有普通琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀摊布，在35～37℃培养7日，取菌苔少许涂片，革兰氏染色镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在70～75℃水浴内加热30分钟将菌体杀死，待冷后放冰箱贮藏为浓菌液。

日常用菌悬液：取上述浓菌液，用灭菌水1:3稀释至灭菌试管中，冰箱保存备用。

4.2.3.2 短小芽孢杆菌（63202）悬液：取短小芽孢杆菌工作用菌种普通琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽孢悬液。

4.2.3.3 藤黄微球菌（28001）悬液：取藤黄微球菌工作菌种的普通琼脂斜面培养物，用1ml培养基Ⅲ将菌苔洗下，用吸管移至盛有普通琼脂培养基的扁培养瓶中，将菌液布满培养基表面，将培养瓶反放于培养箱中26～27℃培养24小时后，取出用吸管吸取培养基Ⅲ5ml，至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大管中备用。

该菌液在冰箱中保存，可使用1～2月。

试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，保持菌种的新鲜，对易变的菌株如藤黄微球菌等在制备菌液前进行单菌落的分离，选择型菌落以保持菌悬液中菌群的一致性，所得抑菌圈边缘清晰、整齐。

4.2.4 仪器的准备：4.2.4.1 双碟：4.2.4.1.1 碟底平度检查：未使用过的双碟应进行碟底平度检查，其方法为：将双碟放在水平台上，下垫一张白纸，碟内加水2～3ml再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。

4.2.4.1.2 将洁净干燥的平皿叠放整齐，每10个包成一包，置于电热鼓风干燥箱内150～160℃干热灭菌2小时，备用。

4.2.4.2 陶瓦盖：每10个包成一包，置于电热鼓风干燥箱内150～160℃干热灭菌2小时，备用。

4.2.4.3 钢管：置铝制饭盒内，于电热鼓风干燥箱内150～160℃干热灭菌2小时，备用。

4.2.4.4 灭菌刻度吸管：先用少许棉花塞于吸管口端，塞进的棉花尖大小适度，太小则松，吹吸时将随同气流上下移动而失去作用，太大则紧，致阻塞空气的流通而使吹吸不便，最后将吸管一一分别用纸包裹，再用牛皮纸每10支包成一束（包装吸管口端恒位于包扎纸张折叠的一端），120℃以上干燥灭菌2小时或121℃蒸汽灭菌30分钟，备用。

4.2.4.5 毛细滴管：置铝制饭盒中，在120℃干燥3小时后备用。

4.2.4.6 称量瓶：在120℃干热3小时，待冷至70～60℃时，取出置于干燥器中备用。

4.2.4.7 其他玻璃仪器：每次应用前应按玻璃仪器清洁规程进行清洁备用。

4.3 试验操作：（各品种抗生素试验设计参照表一）4.3.1 试验溶液的制备：4.3.1.1 标准品溶液的制备：标准品的使用和保存，应按照标准品说明书的规定，临用时按其理论值称取一定量，稀释成约1000u/ml的溶液。

4.3.1.2 供试品溶液的制备：精密称（或量）取供试品适量，用各药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度。

4.3.1.3 称量前，将标准品从冰箱取出，使与室温平衡，供试品应放于干燥器内至少30分钟方可称取。

4.3.1.4 称量：按称量法操作规程进行称量，供试品与标准品应用同一天平。

4.3.1.5 标准品与供试品的称量最好一次取样称取，不得将已取出的标准品或供试品倒回原容器内，标准品称量不可少于20mg，取样后立即将称量瓶及被称物盖好，以免吸水。

称样量的计算：W＝V×C P式中：W为需称取标准品或供试品的重量（mg）V为溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶的体积量（ml）；C为标准品或供试品浓溶液的浓度（u/ml或u/mg）；P为标准品的纯度或供试品的估计效价（u/mg或μg/mg）4.3.1.6 稀释：稀释操作应遵照容量分析的操作规程。

4.3.1.6.1 从冰箱中取出的标准品溶液，必须先在室温放置，使其温度达到室温后，方可量取。

4.3.1.6.2 标准品与供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释，取样量不得少于2ml为宜，稀释步骤一般不超过3步。

举例：取浓溶液1000u/ml第一步取5ml(1000u/ml)→50ml容量瓶→100u/ml取5ml(100u/ml) →50ml容量瓶→10u/ml(H)取5ml(100u/ml) →100ml容量瓶→5u/ml(L)4.3.1.6.3 每次吸取溶液用密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2～3次，吸取样品溶液后，用滤纸将外壁多余液体擦去，从起始刻度开始放溶液。

4.3.1.6.4 稀释标准品与供试品用的缓冲液应同一批和同瓶，以免因PH或浓度不同影响测定结果。

4.3.1.6.5 稀释时，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液体完全流下，再准确补加至刻度。

4.3.1.6.6 采用二剂量法时标准品与供试品高、低溶液浓度之比为2:1或4:1，所选用的浓度必须在剂量反应直线范围内。

4.3.2 培养基的融化：将制备好的培养基在水浴中加热至融化（应避免直火加热）。

4.3.3 操作人员将准备好的实验用品移至半无菌操作间，用75%酒精棉球擦拭工作台面及消毒双手。

4.3.4 双碟的制备：在半无菌室内进行，应注意微生物及抗生素的污染，4.3.4.1 底层：用灭菌的大口吸管（20ml），吸取已融化的培养基20ml注入双碟内，等凝固后更换干燥的陶瓦盖，放于35～37℃培养箱中保温，使易于摊布菌层。

4.3.4.2 菌层：取出试验用菌悬液，按已试验妥的菌量（二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～24mm），用灭菌吸管吸取菌悬液加入已融化并保温在水浴中（一般细菌48～50℃，芽孢可至60℃）的培养基内，摇匀作为菌层用。

用灭菌大口10ml吸管，吸取菌层培养基5ml，使均匀摊布在底层培养基上，置水平台上，用陶瓦圆盖覆盖，放置20～30分钟，待凝固，备用。

4.3.4.3 放置钢管：用钢管放置器将干热灭菌的镊子将钢管装于玻璃管中，放于钢管放置器上，将双碟打开，放入双碟台上，托起双碟台，使钢管平稳落在培养基上，注意使各个钢管下落的高度基本一致。

钢管放妥后，应使双碟静置5～10分钟，使钢管在琼脂内稍下沉稳定后，再开始滴加抗生素溶液。

4.3.5 滴加抗生素溶液：4.3.5.1 每批供试品取4～10个双碟，滴加溶液用毛细滴管，在滴加之前须用滴加液洗2～3次。