γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及其生物活性

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.004 ·论著·γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及其生物活性李文娟，冯震，薛晓敏，黄静，吴自荣【摘要】目的研究一种低毒性的顺铂复合物：γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物（γ-PGAasp-CDDP），考察其体外性质和体内毒性，并探讨可能的作用机制。

方法γ-聚谷氨酸与天冬氨酸发生酰胺化反应制备γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，核磁共振对其结构进行表征；化学法制备γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物；常规方法检测该复合物稳定性；透析法研究药物缓释效果；MTT 法检测复合物体外抗肿瘤细胞活性；流式细胞仪检测其对细胞凋亡的作用；小鼠体内实验检测其体内毒性。

结果成功制备γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物，顺铂的有效结合率达 30%；该复合物在常温中性环境下稳定；30 h 时顺铂的累计释放率达到 30%；细胞实验表明复合物对Bcap-37（人乳腺癌细胞）和 BEL7404（人肝癌细胞）具有显著的杀伤作用，小鼠体内实验表明该复合物的毒性比游离顺铂低。

结论γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物仍然保留了游离顺铂的生物活性，在杀伤肿瘤细胞、引起细胞凋亡的同时，大大降低了体内毒副作用，其作用机制可能与实体瘤组织的高通透性、滞留效应（EPR 效应）以及药物缓释作用有关，因此该复合物具有潜在的临床应用价值。

【关键词】药物载体；药物释放系统；顺铂；γ-聚谷氨酸-天冬氨酸 中国医药生物技术, 2010, 5(2):98-104恶性肿瘤是当前严重影响人类健康的主要疾病之一，顺铂[cis-dichlorodiammineplatinum（II），CDDP]类配合物是目前应用最为广泛的抗肿瘤药物，但因其具有严重的毒副作用，限制了临床应用[1]。

将抗肿瘤药物载于高分子载体上，靶向性输送到肿瘤组织（即被动靶向）[2]，极大地提高了药物的生物利用率，有效地降低药物的毒副作用并提高用药剂量，是目前药物释放领域研究的热点之一，国外报道的有微球体、纳米微粒、脂质体和微型胶囊等[3-7]。

本实验室曾以γ-聚谷氨酸作为载体连接顺铂，制备聚谷氨酸-顺铂复合物，并取得较好的结果[8]。

但是仅以小分子γ-聚谷氨酸作为载体还存在载药量低和载体用量大的缺点，本文采用了一种连接效率更高的新型药物载体：γ-聚谷氨酸-天冬氨酸，利用其活性基团羧基连接顺铂，制备γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物，并对其体内外性质进行研究。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 H-Asp（O t Bu）-O t Bu·HCl（Asp，Mr 296.8）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）购自吉尔生化（上海）有限公司；γ-聚谷氨酸标准品、顺铂（CDDP，纯度 > 99.9%）、噻唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）购自美国 Sigma 公司；三氟乙酸（TFA）、邻苯二胺（OPDA）购自上海化学试剂公司。

1.1.2 主要仪器 ELx800 酶标仪为美国 Bio-Tek 公司产品；FACScan 流式细胞仪为美国 Becton Dickinson 公司产品；Avance 500 MHz 核磁共振仪为德国 Bruker 公司产品。

1.1.3细胞系枯草芽孢杆菌（Bacillus．sp）由本实验室筛选并保存；Bcap-37 细胞（人乳腺癌细胞）、BEL7404 细胞（人肝癌细胞）购自中国科学院上海细胞研究所；DMEM 培养基（Gibco）（含10% 小牛血清）购自吉尔生化（上海）有限公司。

1.1.4实验动物昆明小白鼠，雌性，5 周龄，体重 18 ~ 20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，质量合格证号：SCXK（沪）2007-0005。

1.2 方法1.2.1γ-聚谷氨酸-天冬氨酸聚合物的合成及结构表征由枯草芽孢杆菌发酵得γ-聚谷氨酸[9]，利用温和降解法[10]，调 pH 至 4.0，80 ℃水浴 165 min基金项目：上海市科委 2008 年度重点科技攻关专项（08431902400）作者单位：200062 上海，华东师范大学生命科学学院通讯作者：吴自荣，Email：zrwu@收稿日期：2009-12-02后冰浴冷却，调 pH 至中性，透析纯化，冷冻干燥得小分子γ-聚谷氨酸（sγ-PGA）。

将sγ-PGA、Asp 及 EDAC 按摩尔比4:2:3 以蒸馏水充分溶解，搅拌 4 h，离心收集白色沉淀，加 TFA，37 ℃振荡反应 2 h 后，加入 10 倍体积的无水乙醚，离心收集白色沉淀。

将得到的固体溶于蒸馏水中，调pH 至 7.0，透析纯化 48 h，冷冻干燥，即得载体γ-聚谷氨酸-天冬氨酸（γ-PGA-asp）。

0.8% 的琼脂糖凝胶电泳测定其分子量[11]（以下称电泳法）。

γ-PGA-asp 结构表征：将 15 mg 样品溶于500 μl D2O 中，利用Avance 500 MHz 核磁共振仪进行核磁共振 H 谱（1H NMR）检测。

1.2.2γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及分子量测定将γ-PGA-asp、CDDP 以摩尔比5:1 混合，去离子水溶解，调 pH 至 7.0，密封，避光37 ℃温育 48 h。

透析纯化 48 h 后，收集样品，OPDA 法进行 CDDP 定量[8]，定量后样品冷冻干燥，得到白色絮状产物，即γ-PGAasp-CDDP 复合物。

电泳法测定其分子量。

有效结合率=（检测到的顺铂质量/参加反应的顺铂总质量）× 100%。

1.2.3γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物稳定性实验1.2.3.1不同温度对γ-PGAasp-CDDP 复合物的影响γ-PGAasp-CDDP 复合物样品 500 μl /管分装，分别置于4、37、60 ℃水浴。

分别在第0、10 天取样，电泳法检测其载体变化，OPDA 法检测药物稳定性[8]。

1.2.3.2不同 pH 值对γ-PGAasp-CDDP 复合物的影响γ-PGAasp-CDDP 复合物样品分别调 pH 至 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，37 ℃水浴，检测方法同 1.2.3.1。

1.2.4γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物对顺铂的缓释作用将γ-PGAasp-CDDP 复合物溶液（已知CDDP 浓度 1 mg/ml）加入透析袋中放入 37 ℃磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）中透析 48 h，每隔 1 h 从透析液中取 1 ml 样品，同时再加入 1 ml 新 PBS 溶液，每隔 10 h 取样，用 OPDA 法检测 CDDP 的量，并计算其累计释放率。

1.2.5γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物对肿瘤细胞的影响1.2.5.1γ-PGAasp-CDDP 复合物抑制细胞增殖作用将 Bcap-37 和 BEL7404 细胞分别在 96 孔（l × 104 个细胞/孔）细胞培养板中培养 24 h，待细胞贴壁去除培养基，再加入含不同浓度游离 CDDP、γ-PGAasp-CDDP 复合物的新鲜培养基 200 μl /孔，每个浓度做 4 个复孔，置于 37 ℃，5% CO2培养箱中分别培养 24、48、72 h。

每孔加入 20 μl 浓度为 5 mg/ml 的 MTT，继续培养 4 h。

吸去培养液，加入 200 μl DMSO，充分振荡，于酶标仪波长570 nm 处测定吸光值，并计算 IC50 值。

1.2.5.2 γ-PGAasp-CDDP 复合物对细胞凋亡的影响于 25 cm2 的细胞培养瓶中分别培养 Bcap-37 和 BEL7404 细胞，待细胞长至 80% 时加 20 μg/ml 的药物作用 24 h，分别设定对照组（游离 CDDP），实验组（γ-PGAasp-CDDP 复合物），处理样品[11]，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物在正常小鼠体内的毒性实验昆明雌鼠按体重分为 3 组：PBS 组、游离 CDDP 组及γ-PGAasp-CDDP 复合物组，每组 10 只。

分别于第1、4、7 天以腹腔注射给药，注射剂量为 4 mg/kg（以 CDDP 计量）。

每天记录小鼠的存活和体重变化情况。

2 结果2.1 药物载体 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸的制备及结构表征由枯草芽孢杆菌发酵得大分子γ-聚谷氨酸（γ-PGA），利用温和降解法制备得小分子聚谷氨酸（sγ-PGA），sγ-PGA、Asp 在 EDAC 催化作用下，发生酰胺化反应，形成复合物γ-PGA-asp。

透析纯化后，冷冻干燥得γ-PGA-asp，氨基酸分析得γ- PGA-asp 中γ-PGA:Asp 约为 2 ~ 3:1（摩尔比，数据未显示），合成路线及模式图见图1。

γ-PGA-asp 结构表征1H-NMR（D2O）结果见图2。

其中，δ1.95、1.9 ppm 处为γ-PGA 的β-CH2-峰，δ2.3 ppm 处为γ-PGA 的γ-CH2- 峰，δ4.25、AB 图 1 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸合成路线及其模式图Figure 1The synthesis route of γ-PGA-asp and its ideographγPGA:β-CH 2γ-CH 2ASP:β-CH 2α-CHNHppm 9 8 7 6 5 4 3 2 １图 2 γ-聚谷氨酸-天冬氨酸的核磁共振 H 谱Figure 2 1H NMR of the γ-PGA-asp图 3 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的合成路线模式图Figure 3 The synthesis route ideograph of the γ-PGAasp-CDDP4.41 ppm 分别为 γ-PGA 和 Asp 的 α-CH- 峰，δ2.95 ppm 为 Asp 的 β-CH 2- 峰，δ8.06、8.35 ppm 处为 γ-PGA 和 Asp 的 -NH- 峰。

该结果说明 γ-PGA 与 Asp 已连接。

2.2 γ-聚谷氨酸天冬氨酸-顺铂复合物的制备及分子量测定CDDP 通过其上的 Cl 原子与载体侧链上的活性基团羧基反应，形成化学键获得 γ-PGAasp-CDDP 复合物，CDDP 与载体有多种结合方式，图 3 模式图为其中三种类型。

OPDA 法检测 γ-PGAasp-CDDP 复合物中可逆结合的 CDDP 的量，有效结合率达 30%。

电泳法测定复合物的分子量，结果如图 4所示：泳道 4 为载体 γ-PGA-asp ，分子量约为 20 ~ 60 kD；泳道 5 为 γ-PGAasp-CDDP 复合物，说明载体 γ-PGA-asp 连接上 CDDP 以后分子量变大，约为 30 ~ 60 kD 。