分子标记辅助选择(MAS)与QTL定位在鸡遗传育种中的应用

分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位在鸡遗传育种中的应用摘要：近年来，随着畜禽基因组研究计划相继开展，分子标记的研究与应用得到了迅速的发展，这为准确地评价畜禽群体遗传结构及遗传多样性提供了新的机遇。

分子标记辅助选择（MAS）也越来越受到育种学家的广泛关注，并且目前已用于生产实践，对提高经济效益和育种效率起到了大的推动作用。

而对鸡的染色体上QTL定位工作也有了迅猛的发展，成为动物基因定位工作中一个异常活跃的领域。

对鸡数量性状的研究也已发展为直接将研究目标指向各个数量性状位点，借助各种遗传标记，构建遗传连锁图谱，通过一定的统计分析方法，从而将影响数量性状的多个基因定位于特定的染色体区域。

分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位之间具有紧密联系。

本文主要综述分子标记辅助选择（MAS）与QTL定位在鸡遗传育种中的研究进展。

关键词：鸡；分子标记辅助选择（MAS）；QTL定位1.引言鸡的许多经济性状属数量性状，该类性状的发生受到2对或更多对等位基因的控制，每对等位基因没有显性与隐性的区别，而是共显性的。

这些等位基因对该数量遗传性状形成的作用微小，所以也称为微效基因(minor gene)，它们在染色体上的位置称为数量性状基因座(quantitative trait loci，QTL)。

目前随着QTL 研究的深入，不仅丰富和发展了数量遗传学的内容，成为新兴的分子数量遗传学的主体，也必将对畜禽的育种改良起到极大的推动作用，从而开创动物育种的新纪元。

2.分子标记辅助选择（MAS）2.1 相关概念Stam（1986）提出通过限制性片段长度多态性（RFLP），可对生物有机体的基因组进行标记，利用标记基因型能非常准确地估计数量性状的育种值，以该育种值为基础的选择，称为标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）。

Lander 和Thompson（1990）定义标记辅助选择，为把分子遗传学方法和人工选择相结合达到性状（traits）最大的遗传改进，人们进一步将MAS定义为以分子遗传学和遗传工程为手段，在连锁分析的基础上，运用现代育种原理和方法，实现性状最大的遗传改进。

2.2 常用分子遗传标记及应用目前常用于家禽遗传育种的分子遗传标记主要有：(1)限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP);(2)DNA指纹(DNA fingerprint，DFP);(3)随机扩增多态DNA(Randomly Amplified polymorphisms DNA，RAPD);(4)微卫星DNA(Microsatellite DNA);(5)单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP);另外随着仪器的改善和技术的不断提高，现在也发展了很多新型、高效的检测突变的方法。

下面主要介绍目前家禽遗传育种中常用的分子遗传标记。

2.2.1限制性酶切片段长度多态性(RFLP)RFLP标记是80年代初发展起来的第一代分子标记技术。

所谓RFLP，是指用限制性内切酶处理不同个体基因组DNA后，含同源序列的酶切片段在长度上的差异。

其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针(RFLP标记)进行分子杂交，再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。

现在的RFLP标记一般与PCR 技术结合起来应用。

根据待分析的DNA片段序列，设计特异引物，经PCR扩增，再用适当的限制性内切酶酶解。

由于待分析的DNA片段不太长，酶解后片段不会太多，这些酶切片段经琼脂糖凝胶电泳，就可根据片段的大小将其分开。

凝胶用溴化乙锭染色后，可直接在紫外灯下观察结果，比较限制性酶切片段的多态性。

徐日福等（2005）在鸡的基因组中扩增了MHCB-LB基因第2外显子长度为374 bp的片段，通过克隆、测序，发现了20个B-LB等位基因。

对第2外显子6个限制性酶切位点的PCR-RFLP多态性进行分析，并运用在这6个位点所观测的纯合基因型组合对B-LB等位基因进行初步检测，结果显示，该方法的等位基因检出率可达65％，等位基因主型检出率为68.75％。

2.2.2 DNA指纹标记1985年Jeffreys A.J等制备出在哺乳动物和鸟类基因组DNA中检测出高度多态性的两个小卫星探针,即33.15探针(核心序列为AGAGGTGGGCAGGTGG)和33.6探针(核心序列为AGGGCTGGAGG3)用类似于RFLP分析方法，在低严谨的条件下，利用小卫星探针与基因组DNA的酶切片段进行Southern杂交，可以得到10多条的杂交图带。

由于不同的个体得到不同杂交图谱，就像不同的人具有特异的指纹标识一样，所以称之为DNA指纹。

DNA指纹具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性及体细胞稳定性四个特点。

盛浩伟等以EAV(禽内源性反转录病毒片段)为探针,EcoR I为限制性内切酶对新扬州鸡DNA指纹图谱进行了研究。

结果表明：DNA指纹J带在新扬州鸡上存在，并对新扬州鸡早期增重具有减效效应，可作为新扬州鸡早期增重的遗传标记进行标记辅助选择。

2.2.3 RAPD标记Williams等于1990年首次运用随机引物对基因组DNA进行PCR扩增，成功获得了作为分子标记的多态DNA片段。

RAPD技术具有操作简便快捷，所用引物较短(通常为10个碱基)，引物来源丰富而广泛，无需知道引物和模板DNA的序列，相同引物可以用于不同动物的基因组DNA多态牲检测，材料面广，样品用量少，灵敏度高等特点，目前已被广泛应用于畜禽群体遗传结构的分析。

Sharma等(2001)应用RAPD技术研究5个鸡种群间的变异，发现50条随机引物中12条引物会产生多态性的RAPD图像，96条扩增片段中有25％显示多态性。

研究结果表明，RAPD技术在探索鸡种群间的多态性及确定它们间的遗传距离具有高效性，同时发现白色来航鸡与其它品种遗传相似性很低。

2.2.4 微卫星标记微卫星DNA(Microsatellite DNA)，又称简单重复序列或短串联重复序列，由1-6 bp重复序列构成的微卫星本体和两侧的侧翼序列所构成，广泛分布于真核生物的基因组中。

在微卫星DNA重复序列即微卫星本体中，可变重复数的核心序列头尾相连组成串联重复序列，其可变重复数构成了微卫星DNA多态性的基础，而微卫星座位串联重复碱基的长度是影响其突变率的主要因素。

与传统的标记方法相比，微卫星标记，因其高度的多态性、广泛而又随机地分布于整个基因组以及共显性遗传的特点，目前已经成为群体遗传结构、遗传多样性研究中的最普遍最有效的工具之一。

微卫星多态性分析在畜禽遗传多样性评估、品种资源的分类和保存等方面发挥着重要作用。

陈红菊等(2003)利用5个微卫星标记分析了日照麻鸡、寿光鸡、莱芜黑鸡、济宁百日鸡、鲁西斗鸡、安卡黄鸡和广西黄鸡的遗传多样性，结果表明日照麻鸡与济宁百日鸡的距离最近，鲁西斗鸡与其他鸡种距离均较远。

2.2.5 SNP标记2.2.5.1 SNP的基本概念单核苷酸多态性(Single Nucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是人类和动物基因组中普遍存在的一种分子标记。

SNP在基因组中密度高，在入类基因组中估计每300-1000bp 出现一个，其遗传稳定性较高，尤其是位于基因表达序列内的cSNP(SNP in cDNA sequenes)有可能直接影响基因的表达水平或蛋白质结构，影响着生物系统的表达调控网络，从而引起性状表型的变化。

因此SNP位点及其突变关联分析在基因功能研究中得到了广泛的应用。

鸡的SNP遗传图谱也已完成，整个鸡的染色体含有280万个SNP位点。

从对生物的遗传性状的影响上来看，SNP又可分为两种：一种是同义SNP(Synonymous SNP)，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义SNP(non·synonymous SNP)，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。

SNP 中约有一半为非同义突变。

SNP用作遗传标记具有以下优点：(1)SNP在动物群体中是等位基因性的，在任何群体中其等位基因频率都可估计出来。

(2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。

在人类群体中，SNP的频率约占l％甚至更高。

(3)与串联重复的微卫星座位相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP)，前者的高突变率容易引起对群体的遗传分析出现困难。

对于大规模的研究而言，它比微卫星标记和其他的重复序列更可靠。

(4)部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是性状、疾病遗传机制的候选改变位点。

(5)易于进行自动化、规模化分析，缩短了研究时间。

2.2.5.2 SNP的检测方法由于SNP的二态性，非此即彼，使其具备其他分子标记无可比拟的优越性，奠定了应用DNA微阵列、DNA芯片等高新技术来发现与检测生物基因组之间差异的基础。

从技术上来讲，凡是检测点突变的方法都可用于鉴定SNP，但迄今为止还没有任何一种方法是万能的。

经典方法采用PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析、RFLP等，由于它们必须通过凝胶电泳等进行分析，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。

RFLP只能检测到SNP的一部分。

上述方法仅能判断SNP的有无而不能知道碱基类型，因此这些方法发现的SNP需用进行序列测定加以确认。

在几种用于检测突变的PCR相关技术中，PCR-SSCP分析可能是最易操作而且是最灵敏的方法之一。

该方法的基本原理是：经PCR扩增的DNA片段在变性剂(如甲酰胺)或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，然后于一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当DNA发生碱基置换突变(点突变)时，会造成单链构象不同，通过显色或显影在凝胶上显示出带型的差别，即多态性。

PCR-SSCP检测突变的能力依赖于突变对分子折叠的影响以及分子折叠对电泳迁移率的影响。

目前还不能在理论上预测这些因素，因此在理论上估计PCR-SSCPP 的灵敏度非常困难，根据经验估计其灵敏度也很困难，因为这种灵敏度明显依赖于被检测片段的序列。

检测片段越长，PCR-SSCP分析的灵敏度越低，因此要把长的片段先降解成短的片段再进行SSCP分析。

这样可以通过在重叠的亚片段上分别扩增目标序列或者通过先扩增完整片段，再用适当的限制性内切酶消化扩增片段来完成。

2.2.5.3 SNP在鸡遗传育种中的应用在鸡遗传育种的过程中，人们一直致力于寻找一些可靠的遗传标记来提高育种效率。