疏水层析法分离纯化脂肪酶的研究
脂肪酶的分离纯化
脂肪酶——来源
脂 植物：油料作物的种子
肪
酶 的
动物：高等动物的胰脏和脂肪组织
来
源 微生物：细菌、酵母菌和霉菌
脂 提取法：从动植物器官或组织中提取
肪
酶 的 提
化学合成法：分析酶的氨基酸组成顺序 ,再用化学 方法合成
取
发酵法 ：利用微生物的生命活力 , 通过人工控制而
获得人们所需的酶--假单胞菌属，黑曲霉，米曲霉
脂肪酶——结构
• 绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组 成, His，Ser与另一种氨基酸残基(如Glu或Asp 等)
一起构成脂肪酶催化活性中心的三联体。
残基 261 和 257 的羰基氧原子 为Ca2+配基;顶端的α螺旋( 浅色 的) 表示“盖子”状结构。当脂 肪酶与界面相接触时,此盖打开, 通过亲电子域的创造导致脂肪酶 的构象改变,此亲电子域在丝氨 酸残基周围,由疏水残基的暴露 和亲水残基的包埋来完成。这种 结构有利于催化过程中底物对活 性中心亲和力的提高以及活性 中间体的稳定。
• （氮源）大豆粉 2 ％ (NH4)2 SO4 0.1 ％ （碳源）玉米浆 5 ％ K2HPO4 5.5 ％ 聚乙二醇壬基笨 醚 0.6 ％
微生物脂肪酶的发酵过程
无 菌 空 气
发酵液
脂肪酶的下游分离提取工艺
预处理 过滤 菌体 水洗
（破碎）
过滤
滤液+ 洗液（含酶稀溶液）
硫铵
超滤
无菌过滤
浓缩液 辅料
• “盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结 构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部， 当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐 藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域， 引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的 亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。 酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了 脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活
脂肪酶的提取与分离纯化
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3.2.3 纯化脂肪酶的分子量测定
为了估计部分纯化的脂肪酶的近似分子量，采用标准蛋白质标记物进行了
sds-page的研究。所获得的这些带都是银染色的，并与活性染色所获得的区
域进行比较，以确定近似的分子量。为了确定分子的重量，用标记(mr)的分 子量和每一种蛋白质(mm)所移动的距离绘制了一个校准曲线。测定了目标蛋 白质的距离，并通过方程(从校准曲线中获得)来确定蛋白质的近似分子量。发 现MTCC5695脂肪酶的分子量大约在19.172 kDa。研究了与水解区相对应 的相应区域，并对该酶的分子量进行了分析。实验重复了三次，并研究了距 离的平均值。
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3.2.1 ATPS系统的选择
连接带长度的影响 ：
研究了不同的连接带长度在体积比维持在1左右时PEG/NA2HPO4系统的影响
。表3A代表在各自系统不同连接带长度下的脂肪酶分配情况。在MTCC5695脂
肪酶最大脂肪酶回收率为85.95％的情况下，高纯化因子为4.51，比活力为 4024.56U / mg，TLL为41.24％。超过41.24％，MTCC5695的脂肪酶产量下 降，从85.95％降至57.43％。 在任何一种情况下，分离更倾向于底相。 随着两 相成分组分的浓度增加，两相的自由体积减小。
蛋白结合的钙离子可以稳定结构。在Fe3+和Hg2+离子的情况下，脂肪酶活 性完全消失。Hg2+的强烈抑制表明，Hg2+与硫醇基团结合使得酶中存在关 键的半胱氨酸残基。
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3.1 MTCC5695脂肪酶活力的影响因素
有机溶剂 在乙醚存在下的活性最大，然后是甲醇，丁醇，吡啶和乙腈。在乙 醇和二甲苯的存在下观察到活性稍微增加，而丙酮，丙醇和己烷引起脂肪酶 活性略有降低。相反，DMSO和乙酸乙酯导致非常高的活性降低。
黑曲霉脂肪酶的分离纯化
黑曲霉脂肪酶的分离纯化（1）背景简介：脂肪酶全称为三酰基甘油水解酶，是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成脂肪酸和二甘酯、单甘酯或甘油的生物酶。
它除了能够水解脂肪外，还具有催化酯化反应、酯交换反应、酸解反应、醇解反应以及氨解等反应的性质。
（2）理论途径：脂肪酶是蛋白质，因此大部分蛋白质的纯化方法也适用于脂肪酶。
常见的非特异性蛋白纯化方法有沉淀法、疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤等。
文献研究以从极端生境下筛选得到的一株产脂肪酶菌株为研究对象，采用层析的方法分离纯化得到纯脂肪酶，并对其酶学性质进行了研究。
（3）具体操作流程及方法：1）利用形态分析和分子方法对产脂肪酶菌株进行鉴定，并对产酶条件进行优化；2）研究温度、pH、金属离子和蛋白酶抑制剂对粗酶活性影响；3）利用硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等分离纯化脂肪酶；4）对纯脂肪酶进行酶学性质研究和一级结构鉴定。
（4）分离纯化具体方法及结果采用植物油1%（v/v）、酵母提取物1%（w/w）、KH2PO4 0.2%（w/w）、MgSO4 0.05%（w/w）、KCl 0.05%（w/w）等组成的培养基，接种量为1.5%（v/v）时，在28℃、180 r/m 下培养96h 后，发酵液中脂肪酶水解活性最大达到30IU/mL。
经过硫酸铵沉淀、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析，从黑曲霉发酵液中分离纯化了脂肪酶，脂肪酶的酶活回收率为22.1%，纯化倍数为203 倍。
获得的脂肪酶在SDS- PAGE 图谱上显示为单条带，分子量约为41kDa。
酶的最适反应温度为50℃，在20-60℃内有较好的稳定性，60℃处理12h 仍残留90%的酶活；最适反应pH 为 5.0，在pH 3.0-5.0 内具有较好稳定性，pH 3.0 时处理20h 仍存有99%的酶活。
Cu2+、Ca2+对酶活有较大促进作用，而Fe2+基本使酶完全失活；多种极性较大的有机溶剂对其有激活作用。
经MALDI-TOF-MS 鉴定，该脂肪酶与黑曲霉CBS513.88 酯酶具有较高的同源性。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
生物大分子分离纯化技术
二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
生物大分子分离纯化技术
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
生物大分子分离纯化技术
4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
生物大分子分离纯化技术
5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
生物大分子分离纯化技术
三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
生物大分子分离纯化技术
四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤
疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤原理在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。
当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。
这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。
苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。
疏水相互作用介质苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。
因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。
所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。
温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10~100mg∕m1)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。
材料与仪器蛋白质样品液苯基琼脂糖C1-4BNaC1硫酸铉磷酸钠盐层析柱步骤下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。
1.装填5m1苯基琼脂糖C1-4B进入柱内；2.10倍柱床体积层析缓冲液(20mmo1∕1,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱；3.调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。
上样总蛋白量200-500mg；4.3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线；5.用分步梯度法洗脱。
每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱；6.再依次用5倍体积水、5倍体积1mo1/1NaC1和5倍体积水洗柱，使其获得再生。
产脂肪酶真菌的分离鉴定、产酶条件优化及酶学性质研究的开题报告
产脂肪酶真菌的分离鉴定、产酶条件优化及酶学性质研究的开题报告一、研究背景随着人们生活水平的不断提高，高脂肪食品的消费量逐渐增加。
而高脂肪食品的长期摄入容易导致人体各种代谢疾病的发生，如肥胖、高血脂、心脑血管疾病等。
因此，研究开发高效、环保的脂肪降解酶已经成为了当前生物技术领域的热点。
真菌是脂肪酶的主要产生菌种之一。
目前已经分离出多种产脂肪酶的真菌，并在饲料、乳制品、面包等食品工业中得到广泛应用。
然而，目前已知的产脂肪酶真菌种类还很有限，而且其酶学性质和产酶条件也需要进一步的研究和优化。
因此，本课题将通过对自然环境中的微生物进行筛选和鉴定，分离出一株高效产脂肪酶的真菌，并对其产酶条件和酶学性质进行研究和分析，以期为生产上的应用提供科学依据和技术支持。
二、研究内容和方法1. 真菌的分离鉴定本研究将从自然环境中采集样本，通过板培法、毛细管扩散法等方法筛选出能够产生脂肪酶的菌种，并通过形态学、生理生化、分子生物学等方法进行鉴定和分类。
2. 产酶条件的优化通过单因素试验和正交试验等方法，对影响真菌产酶的因素进行优化，如温度、pH值、培养基成分、培养时间等。
3. 酶学性质的研究将分离出的真菌进行大量培养，提取纯化脂肪酶，并进行酶学性质的分析和研究，如酶的催化效率、热稳定性、pH稳定性、底物特异性等。
三、预期结果本研究预计可以成功分离出一株高效产脂肪酶的真菌，并通过优化培养条件、提高酶的活性和稳定性等手段，进一步提高其产酶能力和应用价值。
同时，对其酶学性质和催化机理的深入研究也将为其在工业生产中的应用提供科学依据和技术支持。
四、研究意义本研究将为开发高效、环保的脂肪降解酶提供新的思路和方法，并为其在食品、医药、生物燃料等领域的应用提供技术支持和料源基础。
同时，通过研究其催化机理和特异性等酶学性质，也将为更深入地理解生物催化反应的本质提供新的思路和方向。
疏水层析色谱的原理及应用
疏水层析色谱的原理及应用1. 简介疏水层析色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，简称 HIC）是一种常用的色谱技术，利用样品中溶质与柱上固定相之间的疏水作用来分离和纯化目标蛋白质。
本文将介绍疏水层析色谱的原理和应用。
2. 原理疏水层析色谱的原理基于疏水作用。
在疏水层析柱上，通常使用亲疏水性互补的固定相材料。
样品中的溶质通过与固定相发生疏水作用，从而被留下来。
疏水层析柱的选择参数主要包括固定相的亲水/疏水程度、样品溶液的 pH 值以及溶液中的盐浓度。
3. 疏水层析色谱的应用3.1 蛋白质分离与纯化疏水层析色谱广泛应用于蛋白质的分离与纯化。
根据蛋白质的疏水性质，可以通过调节溶液 pH 值和盐浓度来改变蛋白质与固定相之间的疏水相互作用，实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。
3.2 病毒和肽的富集疏水层析色谱也可以用于病毒和肽的富集。
一些疏水层析柱可以选择性地吸附病毒和肽，并去除其他的杂质物质。
这样可以提高样品中目标物的浓度，方便后续的分析和研究。
3.3 降低样品的复杂性对于复杂样品，疏水层析色谱可以通过去除一部分干扰物质，降低样品的复杂性。
通过人为调节固定相的亲疏水性质，可以实现不同溶质的选择性吸附，并采用洗脱方法将目标物质洗脱出来。
3.4 聚合物分离疏水层析色谱还可以应用于聚合物的分离。
通过调节溶液 pH 值和盐浓度，可以改变聚合物与固定相之间的疏水作用，实现聚合物之间的分离和纯化。
3.5 生物药物制剂的纯化疏水层析色谱在生物药物制剂的纯化中发挥重要作用。
对于重组蛋白质等生物药物，疏水层析色谱可以有效地去除杂质蛋白质和其他有机物，提高药物纯度。
4. 优势和限制4.1 优势•疏水层析色谱对样品中溶质的选择性吸附具有一定的调节性，适用于多种样品分离与纯化；•疏水层析色谱操作简单、设备要求低，易于应用于实验室和工业生产中。
4.2 限制•疏水层析柱通常需要根据样品性质进行特定的预处理和优化；•高盐浓度的使用可能导致样品与固定相缓慢结合，降低目标物质的得率。
脂肪酶的失活动力学与疏水特性研究_邢建宇
Ｔａｂｌｅ2 ＲｅｔｅｎｔｉｏｎｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｌｉｐａｓｅｏｎＳｕｐｅｒＢｕｔｙｌ-5 50
温度 /℃
保留时间 /ｍｉｎ
Ｚ值
40
2.16
21.3
50
2.24
28.1
60
2.39
31.2
脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸 , 通常只有一 条多肽链 , 它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结 构 。蛋白质分子在天然状态下都有一个特殊的三级 或四级结构 , 且蛋白质表面大多数为亲水性的氨基 酸残基 , 而分子内部则主要为疏水性的氨基酸残基 。 在较高温度下热处理一段时间后 , 其分子内部的疏 水键被破坏 , 从而使包藏在分子内部的疏水性氨基 酸残基更多地暴露出来 , 结果使脂肪酶分子与固定 相之间的接触面积发生变化 , 这种接触表面面积的 变化自然导致了 Ｚ值的变化 , 即在固定相及脂肪酶 接触的表面处失去水分子发生了变化 。脂肪酶在分 子构象变化的程度应与热处理的强度有关 。从表观 上来看 , 高温下处理后脂肪酶在疏水层析柱上的保 留时间增加得更明显一些 。 2.3 酶的失活与疏水层析柱中的保留行为 在较高温度的处理下 , 脂肪酶分子的立体结构 发生改变 , 当温度的处理导致分子内部氨基酸残基 的外露时 , 在使用疏水层析进行分析时 , 可以和固定 相之间发生疏水部位接触的面积就会变大 , 则 Ｚ值 变大 , 从而导致脂肪酶在进行疏水层析时保留时间 的延长 , 但是当更多疏水基团外露 , 脂肪酶与固定相 之间的接触只使用其中疏水性较强的表面即可 , 这 样使得脂肪酶与固定相接触的牢靠程度并不取决于 接触表面的面积 , 如表 2所示 , 虽然随着失活程度的 加重 , Ｚ值逐渐增加 , 但是 Ｚ值的变化并不呈简单的
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｌｉｐａｓｅ
黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究
!(,,%1% (- 3#-% 40#%$0% 5 6%0"$(,(12，7)+8"($1 9$#:%*&#/2 (- 40#%$0% 5 6%0"$(,(12 ，;)"+$ J"$$%J， !"#$+
摘
要
黑曲霉 W$JJ 脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、 透析、 GN8N Q29?,/’<2 W,<: W(’@ 阴离子交换层析和 Q29?,62X UL%Y 凝胶
［!-］ 活性平板定性检测法参照 1<JK 的方法。除特殊 说明之外， 脂肪酶活性测定均采用滴定法。
储油厂油污土壤中分离筛选得到。结合菌落 （包括 菌丝体） 形态、 342+ 序列同源聚类分析和 567 序列 限制性内切酶 （ !"# ! ） 酶切电泳图等特征， 参照齐
［!#］ ［!&］ 祖同 和 +889:;< 等的方法鉴定并命名为黑曲霉
!" 卷 # 期 !$$% 年 # 月
生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
&’() !" *’) # +,-.,/0 !$$%
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脂肪酶 （ :/4,30(;(032/’( ,30(?06/’(,<2，NI "Z#Z#Z"， 甘油三酰酯水解酶） 是一类能催化长链脂肪酸甘油 酯水解为甘油和长链脂肪酸 （或者是此反应的逆反
微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展
微生物酯酶的分离纯化技术及应用研究进展酯酶，又称羧酸酯酶，是一类能够对羧酸酯酯键作用的水解酶，可在水分子的参与下，经由水解作用，将酯类切割成酸类与醇类。
酯酶普遍存在于动物、植物和微生物中，在水分子的参与下能够催化裂解酯键形成相应的醇和酸。
微生物酯酶作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性，利用其水解反应、酯转换以及酯合成反应广泛应用于食品、化工、环保等领域。
在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，主要来源是真菌，真菌中主要是青霉、镰孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等l2属，其次是细菌，细菌主要是假单胞菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌等。
另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶。
对于微生物的胞外酯酶，发酵液经离心或过滤去除细胞，将上清液用超滤、盐析或有机溶剂沉淀等方法浓缩粗提;胞内酯酶则需进行细胞破碎再分离，大多数采用盐析或有机溶剂沉淀的方法进行粗提，为了获得更高的纯度，再用凝胶过滤或亲和层析等方法进行细分离。
1. 微生物酯酶的常规分离纯化技术1.1超滤超滤是利用压力或离心力，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化，根据蛋白质分子大小的不同而选择不同分子量的膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，从而使蛋白质得到分离。
1.2盐析法盐析一般是指溶液中加入无机盐类，蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。
一般粗抽提物常用该法进行粗分。
1.3 有机溶剂沉淀法利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。
有机溶剂能降低溶液的介电常数，削弱溶剂分子与蛋白分子间的作用力，从而增加蛋白质分子上带电粒子的相互吸引力，致使蛋白分子聚合沉淀;另有机溶剂溶解于水的同时，能从蛋白质周围的水化层中夺走水分子，破坏水化层，从而使蛋白质沉淀析出。
脂肪酶的分离纯化
贺州学院课程考核试卷（论文）（2013—2014学年第 1 学期）课程名称：酶工程开课单位：化生学院考核年级、专业：11生物工程任课教师：何彩梅论文题目：脂肪酶的分离纯化脂肪酶的分离纯化摘要：采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法，对Candida sp. 99−125 脂肪酶进行了纯化，比活提高了10.0倍，达到27200 U/mg，回收率为35.5%. SDS−PAGE 电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明，该酶最适反应温度为40℃，最适反应pH 值为8.5，在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80 能够促进提高脂肪酶的活性，而铁离子、铜离子和SDS 对其有明显的抑制作用.一．前言脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类重要的酯键水解酶. 与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制备周期短，作用pH 和作用温度范围广，底物专一性强，便于进行工业生产和制备高纯度制剂[1].在众多脂肪酶中，假丝酵母系(Candida sp.)脂肪酶的用途最为广泛，特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质[2]和手性化合物的拆分反应[3].Candida sp. 99-125 是本实验室保存的一类菌种，目前已应用于生物柴油[4]、维生素A 酯[5]、棕榈酸异辛酯[6]等物质的催化合成研究. 然而该菌株生产的脂肪酶中含有大量的杂质，不仅影响脂肪酶的酶活水平，而且对酶促催化反应带来许多不利因素. 为此，本研究采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candida sp. 99-125 脂肪酶，并对纯化后酶的性质进行了研究.2 材料与方法2.1 试剂与仪器粗酶粉，产酶菌株为Candida sp. 99−125，实验室自制；聚丙烯酰胺；液相色谱仪；SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)电泳仪；DEAE Sepharose FF 层析柱和PhenylSepharose FF (Low sub)层析柱.2.2 实验方法2.2.1 粗酶液的制备取2 g 粗酶粉溶于20 mL Tris-HCl (20 mmol/L, pH=7.5)缓冲液，待搅拌均匀离心，取上清液为上柱用的粗酶液. 粗酶液中蛋白的比活为2710 U/mg.2.2.2 离子交换层析法纯化脂肪酶以20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=7.5)平衡离子交换层析柱，上样4 mL 粗酶液. 先以Tris-HCl 缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白，再用0~0.4 mol/L的NaCl 溶液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为15 倍柱体积，最后以1 mol/L NaCl 溶液彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分.2.2.3 疏水层析法纯化脂肪酶向上节得到的高活性脂肪酶样品溶液中加入固体硫酸铵至0.8 mol/L，将该溶液注入经0.8 mol/L 硫酸铵(AS)缓冲液(pH=7.0)平衡的疏水层析柱中. 先用0.8mol/L 硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白，再用0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱，洗脱体积为10 倍柱体积，最后以20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析.2.2.4 脂肪酶活力的测定脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法[7].酶活定义：脂肪酶在40℃, pH 为8.0 的条件下水解橄榄油乳化液产生1 μmol/min 脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位(记为1 U).2.2.5 蛋白质浓度的测定蛋白质浓度的测定采用Bradford 检测法[8]. 标准蛋白质为1 mg/mL 牛血清蛋白(BSA).2.2.6 SDS−聚丙烯酰胺凝胶电泳合并2.2.3 节得到的高活性脂肪酶样品溶液，加入2 倍SDS−PAGE 上样缓冲液，经沸水浴加热3∼5 min，得到电泳样品. 电泳采用浓度为12%的分离胶，控制电压在150 V. 电泳结束后进行考马斯亮蓝染色.3 结果与讨论3.1 脂肪酶的纯化3.1.1 离子交换层析采用DEAE Sepharose FF (1 mL)作为离子交换层析柱，紫外检测器的检测波长为280 nm，流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被DEAE 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，结果表明，洗脱液中不存在酶活性物质. 然后用NaCl 溶液梯度洗脱，结果如图1 所示.图1 层析柱DEAE 分离纯化脂肪酶图1 显示有2 个蛋白吸收峰(A, B)，A 峰的峰形与酶活值构成的峰吻合，说明A 峰为纯化得到的目标脂肪酶蛋白峰，B 峰为杂蛋白峰. 活性测定表明，A 峰的比活为16600 U/mg，纯化倍数为6.1 倍，酶收率为55.7%.但2 峰之间有牵连现象，无法实现完全分离，说明DEAE柱对Candida sp.脂肪酶的分离效果一般.3.1.2 疏水层析采用Phenyl Sepharose FF (1mL)作为疏水层析柱.流动相流速为0.8 mL/min，进样量为4 mL.对上样后未被Phenyl 柱结合的蛋白洗脱液进行酶活测定，表明没有酶活性物质被洗脱出来. 用硫酸铵溶液梯度洗脱酶液的实验结果见图2.图2 表明，以梯度为0.8~0.0 mol/L 的硫酸铵溶液洗脱时，脂肪酶蛋白并没有被洗脱下来，说明脂肪酶蛋白的疏水性比较强，与Phenyl 柱结合牢固；而以20mmol/L Tris-HCl 缓冲液洗脱时，洗脱液则表现出较高的脂肪酶活性. 脂肪酶经Phenyl Sepharose FF 层析柱进一步纯化后，收率为63.7%，纯化倍数为1.6 倍.图2 层析柱Phenyl 分离纯化脂肪酶综上所述，Candida sp. 99-125 脂肪酶在经过DEAE离子交换层析和Phenyl 疏水层析两步纯化后，其比活为27200 U/mg，比粗酶提高了10.0 倍，产品收率为35.5%.3.2 脂肪酶的性质3.2.1 脂肪酶的最适反应温度分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同温度下的酶活性，结果见图4，表明该脂肪酶的最适反应温度为40℃.3.2.2 脂肪酶的最适反应pH 值在37℃下，分别测定纯化后的脂肪酶溶液样品在不同pH下的酶活性，结果见图5，表明该脂肪酶的最适反应pH 值为8.5.3.2.3 脂肪酶的温度稳定性将纯化后的酶液在不同温度下放置1 h 后测定酶活性，结果见图6. 该脂肪酶在高于35℃的条件下容易失活，但在室温(20∼30℃)下放置时具有较好的稳定性. 将酶在室温(20℃)下放置2d，其酶活收率在95%以上.3.2.4 金属离子对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入5 mmol/L 的MgSO4, CuSO4, FeSO4, CaCl2 溶液和2.5 mmol/L 的K2SO4 溶液，在30℃下放置30 min，以不加离子的酶液为对照，分别测定其酶活.图7 表明，Fe2+和Cu2+对此酶有明显的抑制作用；而Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%. 这说明适量的Ca2+能够促进脂肪酶活性的提高，对酶分子的最佳活力构象起稳定作用. 因此，可选择CaCl2 作为活化剂以提高酶活性.3.2.5 表面活性剂和酶抑制剂对脂肪酶活性的影响向纯化后的脂肪酶溶液中分别加入1 mmol/L 的EDTA, β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT)和SDS,以及0.1%的Triton-X100, Tween80, Span60 和Span85，在30℃下放置30 min 后测定酶活，以不加表面活性剂或抑制剂的酶液为对照，结果见图8. 可见加入0.1%的Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而1 mmol/L 的SDS 的引入对酶有抑制作用，EDTA 对酶活性的影响不大，说明该酶不是金属结合酶. 其他表面活性剂和抑制剂对酶活性的影响不大.3.3 假丝酵母系脂肪酶性质的比较Candida antarctica 脂肪酶B 的催化活性强，比活约为9 U/mg (Fluka 公司商品酶，62288 lipase B, Candidaantarctica，recombinant from Aspergillus oryzae)，温度稳定性好，立体选择性高[9]，特别是商品固定化产品Novozyme 435 在60∼80℃下仍保持较高的催化活性[10].Candida rugosa 脂肪酶包含5 个同工酶[11]，不同的同工酶对不同碳链脂肪酸的选择性差别较大，纯化的LipA 比活为750 U/mg[12]，最适反应温度在35∼40℃，最适反应pH 值为7∼8[11].Candida lipolytica 脂肪酶报道较多，姜延程等[13]对该酶采用DEAE−Cellulose DE-52 和DEAE−SephadexA-50 离子交换层析等步骤纯化，比活提高27.4 倍，达到169 U/mg，收率11%；徐岩等[1]采用盐析和透析的方法将比活提高2.69 倍，收率45%；张金红等[14]采用疏水层析法对其进行分离纯化，比活提高了10 倍以上. 但该酶的温度稳定性差，在30℃下存放24 h，酶活损失50%以上[13].4. 结论通过Candida sp. 99-125 脂肪酶的分离纯化及其酶学性质研究，得到如下结论：采用DEAE Sepharose FF 离子交换层析和PhenylSepharose FF (Low sub)疏水层析两步进行纯化，使Candida sp. 99-125 脂肪酶的比活显著提高，达到27200U/mg，为粗酶的10.0 倍，收率为35.5%. 经分析该酶的分子量约为38 kDa.(2)Candida sp. 99−125 脂肪酶纯化后的最适反应温度为40℃，最适反应pH 为8.5. 该脂肪酶在室温(20℃)条件下具有较好的稳定性，放置2 d，其酶活保留达95%以上. Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，Tween80 可略微提高该脂肪酶的活性，而Fe2+, Cu2+和SDS 对其有明显的抑制作用.参考文献：[1] 徐岩, 李建波, 王栋. 解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究 [J].无锡轻工大学学报, 2001, 20(3): 257−260.[2] Bourg-Garros S, Razafindramboa N, Pavia A A. Large-scalePreparation of 3-Hexen-1-yl Acetate Using Candida antarctica Immobilized Lipase in Hexane [J]. Biotechnol. Bioeng., 1998, 59(4):498−500.[3] Maria S C, Jose V S G. Lipase-catalyzed Synthesis of Chiral Amides:A Systematic Study of the Variables that Control the Synthesis [J].Tetrahedron, 1998, 54: 2877−2892.[4] Deng L, Nie K L, Wang F, et al. Studies on Production of Biodiesel byEsterification of Fatty Acids by a Lipase Preparation from Candida sp.99-125 [J]. Chin. J. Chem. Eng., 2005, 13(4): 529−534.[5] Yin C H, Liu T, Tan T W. Synthesis of Vitamin A Esters byImmobilized Candida sp. Lipase in Organic Media [J]. Chin. J. Chem.Eng., 2006, 14(1): 81−86.[6] 陈必强，叶华，谭天伟. 固定化假丝酵母脂肪酶合成棕榈酸异辛酯 [J]. 化工学报, 2004, 55(3): 422−425.[7] 何耀强，王炳武，谭天伟. 假丝酵母99-125 脂肪酶的发酵工艺研究 [J]. 生物工程学报, 2004, 20(6): 918−921.[8] 汪家政，范明. 蛋白质技术手册 [M]. 北京：科学出版社, 2000.42−46.[9] 赵天涛，高静，李伟杰. 南极假丝酵母脂肪酶B 的催化机理及应用前景 [J]. 分子催化, 2005, 19(2): 155−160.[10] Borg P, Binet C, Girardin M, et al. Enzymatic Synthesis of Trieicosapentaenoylglycerol in a Solvent-free Medium [J]. J. Mol.Catal. B: Enzymatic, 2001, 11: 835−840.[11] Vakhlu J, Kour A. Yeast Lipases: Enzyme Purification, BiochemicalProperties and Gene Cloning [J]. Electro. J. Biotechnol., 2006, 9(1):69−85.[12] Rua M L, Fernandez V M, Ballesteros A, et al. Purification and Characterization of Two Distinct Lipases from Candida cylindracea [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1993, 1156: 181−189.[13] 姜延程，谢文磊，张文新. 解脂假丝酵母胞外脂肪酶的提纯和性质 [J]. 吉林大学自然科学学报, 1996, (3): 91−95.[14] 张金红，柳振宇，刘惠君，等. 疏水层析法分离纯化脂肪酶的研究 [J]. 南开大学学报, 2000, 33(2): 95−98.。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
疏水层析原理
疏水层析原理疏水层析是一种常用的分离技术，它利用样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异，实现对混合物中成分的分离和纯化。
疏水层析原理是基于样品成分在疏水固定相和流动相之间的亲疏水性差异而建立的，下面将详细介绍疏水层析原理及其应用。
首先，疏水层析原理的核心是疏水作用。
疏水作用是指非极性物质在水相中受到排斥的倾向，因此在含有疏水基团的分子中，分子内部的疏水基团之间会发生疏水相互作用，使得分子趋向于聚集在一起形成疏水相。
而在疏水固定相中，也存在着疏水基团，因此样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异就是基于这种疏水作用而产生的。
其次，疏水层析原理的应用非常广泛。
疏水层析技术在生物化学、生物医药、环境监测等领域都有着重要的应用。
例如在蛋白质纯化过程中，疏水层析可以利用蛋白质分子中的疏水氨基酸残基与疏水固定相之间的相互作用，实现对蛋白质的分离和纯化。
在药物分析领域，疏水层析也常用于药物的提取和分离，通过调节流动相的成分和流速，实现对复杂混合物中药物的有效分离。
此外，疏水层析原理还可以与其他分离技术相结合，发挥更大的作用。
例如与离子交换层析、亲和层析等技术结合，可以实现对复杂混合物中成分的更精确分离和纯化。
同时，疏水层析也可以与质谱联用，实现对样品成分的快速鉴定和定量分析。
总之，疏水层析原理是一种重要的分离技术，它利用样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异，实现对混合物中成分的分离和纯化。
疏水层析技术在生物化学、生物医药、环境监测等领域有着广泛的应用，而且可以与其他分离技术相结合，发挥更大的作用。
通过对疏水层析原理的深入理解和应用，可以为科研工作者和工程技术人员提供更多的选择和可能性。
脂肪酶工程菌构建、表达、纯化及酶学性质分析
脂肪酶工程菌构建、表达、纯化及酶学性质分析作者：王景乐来源：《畜牧兽医科学》 2019年第9期王景乐（兰州生物药厂，兰州 730070）摘要：脂肪酶属于丝氨酸水解酶，可以在油水界面把甘油三酯水解成甘油及脂肪酸，对于脂合成、脂水解、脂交换等众多反应具有重要的催化作用。
因而，脂肪酶不仅在生物体的代谢中起重要作用，脂肪酶广泛存在于植物、动物以及微生物中。
但天然的脂肪酶通常具有产量低、稳定性差等诸多缺点，无法满足工业生产的需求。
因此，利用基因工程对于脂肪酶的酶学性质进行改造，提升其催化能力与反应稳定性，生产高产的脂肪酶工程菌，具有重要的意义。
关键词：脂肪酶工程菌；构建；纯化；酶学性质中图分类号：Q939.9文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.09.0280 引言在许多生产领域中，催化剂都必不可少。
与传统的化学催化剂相比，脂肪酶作为一种生物催化剂拥有高度催化特异性，而且其对于原料的要求低，带来的副反应少，有助于提高产品的品质。
同时，利用脂肪酶作为催化剂还能起到减少产生有毒副产物和能源消耗的作用，具有广阔的应用前景。
目前，脂肪酶的获得主要是通过基因工程的方法，选择合适的表达体系构建脂肪酶工程菌，并对经过改造后重组的脂肪酶进行纯化，提高其纯度，同时研究其酶学性质找到能对重组脂肪酶活性产生影响的关键因素，进而生产出能满足应用需要的脂肪酶。
1 构建与表达目前可以作为外源性蛋白表达系统的包括酵母、动植物细胞、细菌以及昆虫细胞等。
而脂肪酶作为一种活性蛋白质，用于脂肪酶工程菌的构建，脂肪酶基因的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、枯草杆菌表达系统等。
1.1 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是外源性脂肪酶基因应用最早的表达系统。
该表达系统具有繁殖快、使用范围广泛、产量高以及易纯化等众多优点，主要包括非融合型与融合型2种表达载体。
在大肠杆菌表达系统中，选择合适的表达宿主菌是一个关键的因素，需要考虑不同宿主菌的独特表达特点，以确定其是否合适。
一种高效分离纯化脂肪酶的方法[发明专利]
![一种高效分离纯化脂肪酶的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/97368e8227d3240c8547ef2e.png)
专利名称：一种高效分离纯化脂肪酶的方法专利类型：发明专利
发明人：邓开健,何倩松
申请号：CN200510034122.3
申请日：20050418
公开号：CN1854292A
公开日：
20061101
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种高效分离纯化脂肪酶的方法。
此法包括制备植物油乳化液，并将该乳化液添加到适宜的温度、pH的发酵液中，搅拌后静止一段时间，反应混合物经管式离心机分离成油—水—固三相，此时，大部分脂肪酶被吸附在油相中，后者加一定饱和度的硫酸铵溶液，将脂肪酶沉淀出来。
通过管式离心机收集沉淀。
沉淀经真空干燥即成脂肪酶制剂。
整个分离纯化过程脂肪酶纯度可达80％以上，收得率可达70％以上。
申请人：广州市开恒生物科技有限公司
地址：510300 广东省广州市广州大道南敦和路189号海珠科技产业园403室
国籍：CN
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疏水作用层析
第二部分 药学生化实验实验一. 疏水作用层析【实验目的】通过实验了解疏水作用层析的原理与方法。
【实验原理】疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，我们把这些疏水性基团称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。
不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。
疏水作用层析的基本原理如图所示。
溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。
利用这个性质，在高离子强度下将待分离的样品吸附在疏水性层析介质上，然后线性或阶段降低离子强度选择性的将样品解吸。
疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。
Phenyl-Sepharose TM6 Fast Flow 是疏水性层析介质的一种，这种层析介质是以交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基共价结合。
苯基作为疏水性配体，可以与疏水性物质发生疏水作用。
Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow 结构示意图如下。
O CH 2CH CH 2O OH【实验材料】1．实验器材层析柱（1.6X20cm ）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计2．实验试剂（1）疏水层析介质：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow（2）溶液A ：0.1M Na 2HPO 4, pH7.0+ WP ：固相支持物L ：疏水性配体S ：蛋白质或多肽等生物大分子H ：疏水补丁W ：溶液中水分子P（3）溶液B：0.1M Na2HPO4,pH7.0，1.7M (NH4)2SO4（4）蛋白质样品溶于溶液B【实验操作】1. 层析介质准备：Phenyl-Sepharose TM 6 Fast Flow疏水层析介质保存在20%乙醇中，取出层析介质后，倾出乙醇溶液。
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疏水层析法分离纯化脂肪酶的研究* 张金红 柳振宇* 刘惠君* 刘 静** 俞耀庭 段江燕 (南开大学分子生物学研究所,国家教委生物活性重点实验室,天津,300071) (山西师范大学生物系,临汾,041004)摘要 采用疏水层析法对商业解脂假丝酵母的中性脂肪酶粗制剂进行了分离、纯化,实验以P heny l Sephar ose 为固定相,异丙醇-哌嗪为流动相,经一次柱层析,从该粗酶中分离出的单一脂肪酶的比活可提高10倍以上.SDS-PA G E 法测定其分子量约为20.8kD ;管状等电聚焦法测其等电点约为4.50.关键词:疏水层析;脂肪酶;纯化中图分类号:Q 5560 引 言对于手性药物,并非两种异构体具有相同的活性.它们在生理、毒理、体内分布及代谢等方面均有差异,其中一个有治疗活性,另一个则可能有毒副作用,因此单一对映体的制备对于手性药物的病理、药理研究和临床应用等都具有重要意义.手性化合物单一对映体的合成有多种方法: 由手性源直接合成, 外消旋药物的非对映体结晶或动力学拆分, 由前手性底物不对称合成等等.酶作为天然的手性催化剂,由于来源方便,价格低廉,用于光学活性药物的合成颇具应用潜力.目前,大部分以酶法进行的光学合成都采用粗酶的形式.粗酶制品虽然具有价低和光学稳定的特点,但由于粗酶制剂所含有的杂蛋白及其它物质,一方面使得化学反应整个过程复杂化,另一方面这些物质也可能抵消或抑制酶的活力,限制其立体选择性.鉴于此,粗酶的纯化显得尤为重要.纯化后的酶不仅能大大提高手性药物的拆分效率,也为结晶酶的研究提供了物质保证[1].1 材料与方法1.1 材料解脂假丝酵母脂肪酶(Candida lyp oly tica lipase,简称CLL)无锡酶制剂厂产品;苯基-琼脂糖凝胶(Phenyl -sepharo se CL -4B ),Phar macia 公司产品;其它所用试剂均为国产或进口分析纯.1.2 方法1.2.1 粗酶的提取和纯化[2]: 50g 粗酶中加150mL PBS 缓冲液,4℃磁力搅拌20min,离心,取上清液作为上柱液.Pheny l-Sephar ose Cl-4B 装入层析柱中( 2.5×19.5cm),以200m L 哌嗪缓冲液平衡后,柱顶缓慢加入粗酶提取离心后的上清液,而后以哌嗪缓冲液顶洗至蛋白检测记录仪显示无蛋白流出时,改用异丙醇-哌嗪梯度洗脱,并分步收集,合并酶活高的组分.1.2.2 蛋白测定: 采用染料结合法[3],以牛血清蛋白(BSA )为标准蛋白,用分光光度计测定595nm 处的吸光度.1.2.3 酶活力测定: 采用乙酸对硝基苯酯法[4].第33卷 第2期南开大学学报(自然科学)V ol.33 №22000年6月A cta Scientiar um N atur alium U niver sitatis N ankaiensis Jun.2000收稿日期:1998-10-18*南开大学生化系94级本科生**天津师范大学生物系97级本科生1.2.4 电导测定: 以哌嗪缓冲液与异丙醇按比例混合,在0%～100%范围内配制标准溶液,测其电导,绘制标准曲线.分别测定分部收集溶液的电导,由标准曲线计算出酶活力最高峰的异丙醇的浓度.1.2.5 SDS-PAGE 法测分子量[5]: 合并酶活最高的样品管,除尽异丙醇后,透析除盐并进行冷冻干燥,最后获得白色固体粉末作为电泳样品.电泳采用垂直板型SDS-PAGE-不连续系统.浓缩胶为4.8%,分离胶为10%;电流控制:浓缩胶20mA ,分离胶30mA ;电泳后,经0.25%考马斯亮蓝染色(co omassie brilliant blue R),冰醋酸-甲醇脱色后,与标准分子蛋白比较,确定分子量.1.2.6 等电聚焦法测定等电点[5]: 采用垂直管型系统,电泳胶为5%聚丙烯酰胺.电极缓冲液负极为0.5mol/L NaOH,正极0.5mo l/L H 3PO 4.每一电泳管电流保持2mA,至电压升到160V 后稳压,至电流基本为零时停止电泳.电泳胶条经固定后,考马斯亮蓝显色,参照标准PI 蛋白,确定被分离酶的等电点.2 结果与讨论2.1 粗酶的洗脱和收集选择50m mol /L ,pH 7.0的哌嗪缓冲液,以异丙醇-哌嗪连续梯度进行洗脱,洗脱液在第49～52管和57～60管有两个蛋白吸收峰(280nm ,图略);用染料结合法测定梯度洗脱液的蛋白浓度(图1所示),发现确为两个并排的蛋白峰.但这两种蛋白在粗酶中所占比例很小,如第一个峰蛋白浓度(峰顶)仅占粗酶提取液中总蛋白的2.2%.2.2 粗酶及纯化后脂肪酶的活性用乙酸对硝基苯酯法测定脂肪酶活性,作为疏水层析上柱样品的商业中性脂肪酶的活性为29.86U/mL.从图2可以看到梯度洗脱所出现的两个蛋白峰中,第一个蛋白峰具有很高的脂肪酶活性;而第二个蛋白峰无脂肪酶的活力.图1 C LL 梯度洗脱组分蛋白浓度 Fig 1 The concentration of protein inCLL gradient elution fraction 图2 脂肪酶活性曲线 Fig 2 The curve of lipase activity f rom gradient elution f ractions2.3 异丙醇浓度对酶洗脱的影响哌嗪-异丙醇(0%～100%)混合液电导值和分部收集液各组分的电导值如图3a 、3b .从两图中可以看出,标准哌嗪-异丙醇体系和梯度洗脱分部收集组分的测定电导值基本相同,说明图3a 可以作为异丙醇浓度的标准曲线.根据所测定的各组分的电导值,对照标准电导曲线,可以看出活性高的脂肪酶峰位于16%～25%的异丙醇梯度处.2.4 粗酶与纯化后酶比活力的比较表1的结果显示,解脂假丝酵母中性脂肪酶仅仅经过一次疏水层析,其比活提高了10倍以上.2.5 纯化后酶的分子量和等电点 将接收的第50和第51管洗脱液合并,第52管单放,处理后进行SDS-PAGE 分子量测定(图4),图4・96・ 南开大学学报(自然科学版)第33卷中泳道1为标准分子量蛋白质,泳道2为第50和第51管洗脱液,泳道3为第52管洗脱液。
结果显示,泳道2中有一条蛋白带,分子量约为20.8kD ,而泳道3显示出两条带,说明第52管是在第一和第二蛋白峰的交叉处. 20.8kD 蛋白等电点的测定结果如图5,图5中泳道1为纯化后脂酶,泳道2为标准等电点蛋白,泳道3为标准等电点蛋白和纯化酯酶。
在标准PI 蛋白带与20.8kD 蛋白混合管中,可以看到位于3.50～4.55两带间紧挨4.55的PI 蛋白带有一条非标准PI 蛋白带(箭头所指处),因此推断纯化后20.8kD 蛋白的等电点约为4.50.图3(a ) 哌嗪-异丙醇电导标准曲线 图3(b ) CLL 梯度洗脱组分电导曲线Fig 3(a ) The standard curve ofFig 3(b ) The curve of electric electric conductivity of pepe conductivity of CLL gradient razine and 2-propanol elution fractions 注:每管4mL no te :ev ery tube is 4mL图5 纯化后脂酶等电聚焦Fig 5 Isoelectric f ocusing of purified lipase 图4 纯化后脂肪酶SDS 电泳Fig 4 SDS -PAGE of purif iedlipaseBo rnscheuer U .等人[4]用疏水层析法曾从假单胞杆菌属的粗脂肪酶中分离出一分子量为34.1kD 的脂肪酶.他们的体系是:粗酶采用10m mol /L ,pH 7.0PBS 提取,流动相为10mmo l /L ,pH 5.0哌嗪-异丙醇系统,34.1kD 脂酶位于异丙醇58%～69%浓度范围,由于34.1kD 脂酶的丰度高,所以尽管纯化后的比活只提高了4倍,但在该体系仍能得到结晶酶.本实验以解脂假丝酵母中性脂肪粗酶为材料,采用Bornscheuer 方法不能得到预期效果,说明34.1kD 脂酶在解脂假丝酵母中不存在;改变提取和层析条件(如离子浓度,・97・ 第2期张金红等:疏水层析法分离纯化脂肪酶的研究pH 值等),能得到一种20.8kD 的脂肪酶,由于其丰度不高,这种脂酶不能直接从洗脱液中结晶出来.CLL 是一种商业中性脂肪酶粗制剂,在经过疏水层析分离出等电点为4.50,分子量为20.8kD 的脂肪酶之前,流出液部分仍具有较高的脂酶活性,说明这种粗酶中至少还存在其它的脂肪酶.而梯度洗脱(280nm )的第二个蛋白峰没有脂酶活性,乃是在此粗酶中还存在其它蛋白的证据之一.总之,只经一次疏水层析法即能得到较纯酶或蛋白的结果,为结晶酶的研究提供了重要的启示.参考文献 1 L alonde J J ,Go var dhn C P ,K halaf N K et al .Cro ss -linked Cry st als of Candida r ugo sa lipase :Highly efficientcatalysts fo r the r esolut ion o f Chiral esters .J A m Chem S oc ,1995,117:6845～6852 2 师治贤,王俊德.生物大分子的液相色谱分离和制备.北京:科学出版社,1992 3 Br adfor d M M .A r apid ang sensit ive method fo r quantitatio n o f micr og r am qua nt ities of pr ot ein utilizing the pr incipleo f pr oteindy e binding .A nal B iochem ,1976,72:248～254 4 Bor nscheucr U ,Oscar -W erner R ,L ausch R et al .L ipase o f Pseudomonas cep acia for bio techno lo gical purpose,pur ifica tio n,cry st allization and chara ct erization.B iochimica et Biop hy sica A cta ,1994,1201:55～60 5 王重庆,李云兰,李德昌.高级生物化学实验教程.北京:北京大学出版社,1994PU RIFICA T ION AN D CHARACT ERIZAT ION OF AL IPA SE FROM CA N DIDA L IP OL YT ICAZhang Jinhong,Liu Zhenyu *,Liu Huijun *,Liu Jing**,Yu Yao ting (I nstitute f or M olecular Biology ,B ioactive M aterials Res earch Laborator y ,N ankai ,University ,T ian j in ,300071)Duan Jiang yan(D ep ar tment of Biology ,S hanx i N or mal U niver sity ,L inf en ,041004) Abstract Co mmerical lipase of Candida lip olytica w as purified to homog eneity by a sing le chrom ato graphy on phenyl sepharo se . T he hydrophobic interactio n chr omatogr aphy conditio ns were desig ned and o ptimized.The activity of the enzym e w as measured before and after purification;mo lecular w eight and isoelectric point o f purified enzyme w ere determined .Ex perimental r esults show ed that : With phenyl sephar ose as a par titioner phase ,the m ix ed solvent system of peperazine and 2-pr opanol as a m obile phase,the homog enous lipase w as obtained directly from crude lipase of Candida lip oly tica . By purificaito n,the specific activity of lipase could be raised 12-13fo lds . T his pro tein had a m olecular w eig ht o f 20.8Kda as analy zed by so dium dodecyl sulfate po lyacr ylamide gel electr ophoresis. Isoelectric fo cusing in Coom assie Brilliant Blue R staining revealed a sing le protein band.The protein band is situated betw een the bands of 3.5and 4.55,just below the band of 4.55;therefore the isoelectric point of the protein is abo ut pH4.50.Key words :chr om atog raphy ;pur ificat ion;lipase ・98・ 南开大学学报(自然科学版)第33卷。