蛋白质的性质及分离分析技术
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
蛋白质的理化性质与分离纯化
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
蛋白质的分离纯化(1)
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
简述一般根据蛋白质的哪些性质分离、纯化蛋白质
离子交换层析 带正电的离子交换树 脂结合带负电的蛋白。
（四）利用选择性吸附的纯化 方法
疏水作用层析是根据蛋白质表面的疏 水性差别。
在疏水作用层析中，不是暴露的疏 水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互 作用，而是连接支持介质(如琼脂糖)上 的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水 基团结合。
由于疏水作用层析要求盐析化合物 如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面 的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可
电泳法原理
2、离子交换层析法
蛋白质对离子交换剂的结合力取 决于彼此间相反电荷基团的静电吸引， 而这和溶液的pH有关，离子交换剂有阳 离子交换剂 （羧甲基纤维素 ）和阴离子 交换剂（二乙氨基乙基纤维素 ），当被 分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱 时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白 质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱 下来。
（2）pH值带净电荷越多，它的溶解度就越大。改 变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改 变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度 大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀 蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附 近。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱 而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致 蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋 白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用 偏碱性的提取液。
超滤技术的应用 有很好的前景，应引 起足够的重视。
2、密度梯度（区带）离心
蛋白质沉降不仅决定于它的大小，而且也 取决于它的密度。蛋白质颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量 和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗 粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时， 即停止不前，前后各种蛋白质在离心管中被分 离成各自独立的区带。
蛋白质分离纯化的技术
蛋白质分离纯化的技术前言蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。
而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。
然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。
今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。
一、蛋白质分离的基本原理蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。
蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。
根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。
二、蛋白质分离纯化技术的分类根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：1. 分子筛层析：分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。
这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。
2. 表面等电聚焦（IEF）：表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。
这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。
3. 亲和层析：亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。
如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。
4. 透析：透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。
通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。
蛋白质的理化性质和分离纯化
一、蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，
氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成 正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电 荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
名词解释
等电点（pI） 肽键和肽链 肽平面及二面角 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 蛋白质变性与复性 分子病 肽 一级结构 结构域
三、是非题 1.构成蛋白质的20种基本氨基酸除脯氨酸外，在结 构上的共同点是与羧基相邻α-碳原子上都有一个氨 基。( ) 2.一个氨基酸在水溶液中或固体状态时是以两性离 子形式存在。( ) 3. .构型的改变必须有旧共价键的破坏和新共价键的 形成，而构象的改变则不发生此变化。( ) 4.肽的命名是从肽链的游离氨基开始的。( ) 5.蛋白质分子中肽链能自由旋转。( ) 6.所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。.( )
（二）蛋白质的胶体性质
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自
1 万 至 100 万 之 巨 ， 其 分 子 的 直 径 可 达 1 ～
100nm，为胶粒范围之内。
* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷
水化膜
水化膜
+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质 脱水作用
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用 碱
术。
（四）层析
层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固 态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋
蛋白质的研究方法
蛋白质的研究方法蛋白质是生物体中非常重要的生物分子，研究蛋白质有助于了解其功能、结构和相互作用等方面的信息。
为了研究蛋白质，科学家们发展了许多方法和技术。
本文将介绍一些常用的蛋白质研究方法。
1. 分离和纯化蛋白质通常与其他生物分子混合存在，因此首先需要将其从混合物中分离出来。
分离和纯化蛋白质的常用方法包括盐析、凝胶过滤、离心、电泳和亲和层析等。
这些方法利用蛋白质的理化性质，如电荷、大小、溶解度等，进行分离和纯化。
2. 免疫学技术免疫学技术用于检测、鉴定和定量蛋白质。
常见的免疫学方法包括免疫印迹、免疫组织化学、免疫沉淀和流式细胞术等。
这些方法利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，来检测和分析蛋白质。
3. 质谱分析质谱分析是一种高分辨率的分析技术，可用于确定蛋白质的质量、序列、结构和修饰情况等。
常用的质谱方法包括质谱仪、飞行时间质谱、串联质谱和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等。
这些技术通过将蛋白质分子分离和离子化，测量其质量和离子信号，来分析蛋白质的性质。
4. 核磁共振核磁共振（NMR）是一种能够测量蛋白质在溶液中的空间结构和动力学特性的方法。
通过测量核自旋的相对位置和取向，可以确定蛋白质的三维结构和分析其与其他分子的相互作用。
NMR在研究蛋白质结构、构象变化和动力学等方面具有重要的应用价值。
5. X射线晶体学X射线晶体学是一种通过蛋白质晶体对入射的X射线进行衍射来确定蛋白质三维结构的方法。
这种方法需要制备蛋白质的晶体，并使用X射线衍射仪测量晶体的衍射图样。
通过分析衍射图样，可以推导出蛋白质的原子级别结构信息。
6. 生物物理化学方法生物物理化学方法用于研究蛋白质的结构和功能。
常见的方法包括荧光光谱、红外光谱、圆二色谱、散射和色谱等。
这些方法利用光学、电磁和物理学原理，测量蛋白质的光学性质、构象特征和相互作用等信息。
7. 基因工程和结构预测基因工程技术用于构建和表达蛋白质的基因，以大规模生产蛋白质。
蛋白质分离和鉴定技术
百泰派克生物科技
蛋白质分离和鉴定技术
蛋白质的分离和鉴定是蛋白质组学研究中的重要内容，蛋白质分离是获得蛋白样本的重要来源，蛋白鉴定即对蛋白质进行定性或定量等鉴定，两者通常是前后相继进行的。
理想的蛋白质分离方法首先要具备超高的分辨率，能够将成千上万种蛋白质包括他们的修饰物同时分离并与后续的鉴定技术有效衔接，还应对不同类型的蛋白质，包括酸性的、碱性的、疏水的、亲水的等，均能有效的分离。
常用的蛋白质分离技术包括电泳技术（一维电泳、双向电泳、荧光差异显示凝胶电泳和毛细管电泳等）和色谱分离技术（液相色谱、离子交换色谱、亲和色谱、反相色谱、尺寸排阻色谱等）。
分离后的蛋白质样本可以进行后续鉴定，如分子质量、氨基酸序列含量以及
翻译后修饰鉴定等，目前最常用的蛋白质鉴定技术是高分辨率、高灵敏度和高准确度的质谱技术。
总之，蛋白质的分离和鉴定技术各不相同，蛋白质分离技术在实现蛋白质分离的基础上还可以在一定程度上实现蛋白质的鉴定，如分子质量和含量等；而蛋白质鉴定技术只能对蛋白质的性质进行鉴定，通常需要借助蛋白质分离技术获取待鉴定的蛋白质样本。
百泰派克生物科技配备有高分辨率电泳系统以及色谱和质谱平台，可提供快速高效的蛋白质分离与鉴定分析服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的细胞寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括细胞培养、细胞标记、蛋白提取、蛋白酶切、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
蛋白质的分离纯化技术
蛋白质的分离纯化技术1、根据蛋白质带电性质不同的分离技术1.1离子交换层析以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。
其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类, 还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。
离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。
当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。
随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序先后洗脱下来。
1.2电泳法电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。
现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异和大小差异高分辨率地分离或分析蛋白质。
在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。
2、根据蛋白质溶解度不同的分离技术2.1蛋白质的盐析蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。
2.2有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。
近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。
8-蛋白质化学6-理化性质与分离分析
蛋白质的理化性质、测定及分离纯化一、蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质及应用●蛋白质分子量大，是一种胶体溶液；●具有特定的空间构象，分子量一定→分子筛层析；●在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷→等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；●一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域→有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)。
蛋白质的胶体性质蛋白质分子量大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1-100 nm 范围之内。
球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围--水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。
与低分子物质相比，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可以利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从袋中透出，保留了比较纯的蛋白质--透析(dialysis)。
颗粒大小：在1-100 nm之间，属胶体，因此溶于水，成为亲水胶体。
稳定亲水胶体的因素：水化膜、表面电荷相同不通透性：半透膜(semipermeable membrane)蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。
分散相质点小于1 nm为真溶液，大于100 nm为悬浊液，介于1-100 nm为胶体溶液。
透析即用半透膜（透析袋）将大分子蛋白质分离出来。
在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品，透析法最简便。
●透析时，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜，其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。
欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。
常用温度：4℃，升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器，均能提高透析速度。
蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。
沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。
3 蛋白质的性质及及研究方法
盐析常用的中性盐为硫酸铵；
调节盐析所用的盐浓度和溶液的pH值，可将溶液 中混合的各种蛋白质逐个分开，称为分段盐析法
血浆清蛋白
半饱和 (NH4)2SO4
血浆球蛋白
（2）有机溶剂沉淀法
在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶 的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力 强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质 的溶解度降低而沉淀。
凝胶过滤分离蛋白质
3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 (SDS-PAGE)
电泳是指带电颗粒在电场的作用下向着与其所带电 荷相反的电极移动的现象。 蛋白质在电场中迁移速度的大小与蛋白质在溶液中
所带电荷、蛋白质的分子量大小、颗粒大小及形状
有关。
SDS是一种有效的变性剂，它能破坏蛋白质分子中
2、蛋白质的复性 (renaturation)
复性：若蛋白质变性程度较轻，经适当处理（如透 析法）将变性因素除去后，可缓慢地重新自发折叠 形成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的理化性 质和生物活性，称为复性。
上 世 纪 六 十 年 代 ， Anfinsen C. 完 成 了 牛 胰 核 糖 核 酸 酶
Chapter3 蛋白质的主要理化性质及 分离纯化方法 (The Physical and Chemical Characters of Protein, as well as its Separation and Purification )
蛋白质的相对分子量 蛋白质的两性解离及等电点 蛋白质的胶体性质 蛋白质的沉淀反应 蛋白质的紫外吸收 蛋白质的变性和复性
缺点：常使蛋白质变性失活
(2) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法
蛋白质分离技术
★等电点测定
等电聚焦法（isoelectricfocusing）
（2）蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子量很大（1-100nm），在水溶液中 具有胶体性质，如布郎运动、丁达尔现象不能 通过半透膜等。 透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋，置 水中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋 白质仍留在袋中。 半透膜：只允许小分子通过，而大分子不能通过。 如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。
等电聚焦法
2、离子交换层析法
基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂
电荷基团：
（四） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析
亲和层析:利用蛋白质分子对其配体分子特有的 识别能力。 配基：
酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似 物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与 亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。
（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography)
第四节：蛋白质的重要性质及分离纯化
Release proteins from cells and Differential centrifugation as a first step in protein purification
一、蛋白质的性质
（1）蛋白质的两性解离
蛋白质与aa一样，能够发生两性解离， 也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在 电场中不移动。
（5）蛋白质的紫外吸收
Trp、Tyr和Phe在280nm 附近有最大吸收。 因此，利用这个性质，可以对蛋白质进 行定性鉴定和定量测定。
二、分离纯化蛋白质的主要方法
（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀 法
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蛋白质变性的应用
理论上：
研究蛋白质分子结构与功能,分子量测定,亚单位拆分；
生产生活中有利的一面：
食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；
生产生活中不利的一面：
活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；
四、蛋白质的沉淀作用
1. What’s precipitation of protein?
碱性AA/酸性AA 0.2 1.7 2.9 0.34 等电点 1.0 6.7 10.7 8ห้องสมุดไป่ตู้2
（4）导电性、溶解度、黏度及渗透压都最小。
等电沉淀和蛋白电泳：
迁移率与净电荷量、分子大小、分子形状等有关
一、蛋白质的两性解离与等电点
电泳： What’s electrophoresis? 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳 （electrophoresis） 。
的空间结构被破坏（肽键不断裂，一级结构不
变），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性 质的改变，称为蛋白质的变性(denaturation)。
变性的因素及作用机制
1、变性理论
蛋白质的变性就是天然蛋白质分子中肽链的高度规 则的紧密排列方式因氢键及其他次级键的破坏而变成 不规则的松散排列方式。
2、引起蛋白质变性的因素：
凝胶：蛋白质为连续相，水为分散相形成的网状凝胶体。
二、蛋白质的胶体性质
3.蛋白质凝胶
凝胶具有胀润作用： 分类：（1）可逆性凝胶
（2）不可逆性凝胶
部分破坏水化膜、适当加热和远离等电点
4.蛋白质胶体性质的应用
渗析（透析） 超滤
三、蛋白质的变性、复性与凝固作用
What’s denaturation of protein? 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格
白质具有特殊的分子结构,并经特殊处理则可以复性。
核糖核酸酶的变性与复性
尿素， -巯基乙醇 天然构象 去除变性剂 并缓慢氧化
变性状态
蛋白质变性的可逆性与复性
可逆变性： 变性条件除去后仍可恢复天然状态的变性。
不可逆变性： 变性条件除去后不能恢复天然状态的变性。
蛋白质的热变性与凝固作用
1、热变性 热变性的定义
① 物理因素： 高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波、机械搅拌 ② 化学因素： 强酸、强碱、有机溶剂、尿素、胍、重金属盐等。
变性蛋白质的性质改变
① 物理性质：
旋光性改变，溶解度下降，结晶能力下降，沉降率升高，
粘度升高，光吸收度增加等；
② 化学性质：
官能团反应性增加，呈色反应增强，易被蛋白酶水解。
③ 生物学性质：
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子在一定pH的溶液中可带净的负电
荷或正电荷，故可在电场中发生移动。 不同蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大 小也不同，故在电场中的移动速度也不同， 据此可互相分离。
二、蛋白质的胶体性质
1、蛋白质具有胶体溶液的性质
蛋白质分子的颗粒直径已达1~100nm，处于胶 体颗粒的范围。（亲水胶体） 蛋白质具有胶体溶液的性质：布朗运动、丁道 尔现象、不能透过半透膜、具有吸附力等。
二、蛋白质的胶体性质
2、稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素：
水化膜 ---- 通过氢键与水结合 表面电荷---- 在非等电点状态下，双电层，带
同性电荷蛋白质分子互相排斥。
蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜
+ + +
酸 碱
－
－
+
+ +
+
碱
在等电点的蛋白质
脱水作用
酸
－ －
－ －－ －
带负电荷的蛋白质
第六节 蛋白质的性质及分离分 析技术
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的
氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两
外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋 白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 （precipitation）。
变性后的蛋白质由于疏水 基团的暴露而易于沉淀， 但沉淀的蛋白质不一定都
是变性后的蛋白质。
四、蛋白质的沉淀作用
2.沉淀种类：可逆与不可逆 3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
热变性三个阶段 影响热变性的因素:
温度、砂糖、H+浓度、蛋白质含水量、电解质；
蛋白质的热变性与凝固作用
2、蛋白质的凝固作用
天然蛋白质变性后，变性蛋 白质分子互相凝集或相互穿插 缠绕在一起的现象成为蛋白质 的凝固（coagulation） 。
凝固作用分两个阶段： 首先是变性； 其次失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮;
沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法
四、蛋白质的沉淀作用
2.沉淀种类：可逆与不可逆 3.沉淀方法：
沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析－中性盐沉淀法
（2）有机溶剂沉淀法
（3）酸沉淀法
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein?
原有生物学活性丧失，抗原性改变。
蛋白质变性的可逆性与复性
蛋白质变性的可逆性－复性：
某些蛋白质变性后可以在一定的条件下重新形成原来的空
间结构，并恢复原来部分理化特性和生物学活性，这 个过程称为蛋白质的复性（renaturation）。 蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下不能复性；
如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或蛋
脱水作用
带正电荷的蛋白质
脱水作用
+ + + + + + + +
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
二、蛋白质的胶体性质
3.蛋白质凝胶
凝胶作用：
蛋白质颗粒周围的水膜是不均匀,使它们以一定的 部位结合形成长链。这些长链又彼此结合成为复杂的网 状结构的凝胶体。 溶胶：蛋白质作为分散相，水为连续相形成的溶液。
性解离性质，具有特定的等电点（pI）。
溶液pH＝pI时，蛋白质所带正负电荷相等；
pH＞pI时，蛋白质带净负电荷；
pH＜pI时，蛋白质带净正电荷。
等电点时特点：
（1）净电荷为零 （2）一定离子强度的缓冲液：等离子点特征常数 （3）多数蛋白质在水中等电点偏酸
胃蛋白酶 血红蛋白 细胞色素C 菊糖酶