基因工程药物之干扰素的制备流程课件
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干扰素制备的工艺流程图
提取重组质 粒④
7)用合适转头于室温以5000转/分离心15分钟，回收核酸。如于4 ℃离心， 盐也会生成了沉淀。 8)小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,于室温用70%乙醇 洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所 有液滴，于室温将瓶倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 9)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀. 10)纯化。
质粒DNA的纯
化①
（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA
1)将核酸溶液所得转入15mlCorex管中，再加3ml用冰预冷的5mo1/L LiCl溶液， 充 分混匀，用合适转头于4 ℃下以10000转/分离心I0分钟。LiCI可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34 转头(或与其相当的转尖)于室温以10000转/分离心10分钟，回收沉淀的核酸。
白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标 作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。
(6)残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于
100pg. (7)残余血清lgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法吋必须进行此项检定。
重组体引入宿主 细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体 DNA 分子在 一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。
从大肠杆菌K12获取目 的基因
由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与 目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突 变情况
干扰素的工艺制备流程39页PPT
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事ຫໍສະໝຸດ 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
干扰素的工艺制备流程
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
干扰素制备的工艺流程图课件
干扰素的制备流程
•
PPT学习交流
1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
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6
目的基因与克隆载体进行体 外重组
•
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1
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合
5）用合适转头于4 ℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自
转。如果细 菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未
成致密沉淀块原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。
提取重组质
粒③
4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明
个液相。置冰 上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0 ℃放置后
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
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目的基因与克隆载体进行体 外重组
基因工程药物——干扰素的制备PPT课件
干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀 伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使 细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制； 同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞 和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并 增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活 性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和 淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有 广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免 疫功能等多种生物活性。。
上海生物制品研究所 北京三元基因工程有限公司 长春海伯尔生物技术有限责任公司 深圳科兴生物工程有限公司 哈药集团生物工程有限公司 天津华立达生物工程有限公司 沈阳三生制药有限责任公司 安徽安科生物工程(集团)股份有限公司 ……
干扰素在病毒细胞表面与特殊膜受体结合发挥抗DNA和RNA作 用，包括对某些酶的诱导作用，阻止受病毒感染细胞中病毒 的复制，抑制这些细胞的繁殖。本品具有免疫调节作用，可 增强巨噬细胞的吞噬作用，增强淋巴细胞对靶细胞的特殊细 胞毒性。 1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一 般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。当病 毒感染的恢复期可见干扰素的存在，另一方面用外源性干扰 素亦可缓解感染。 2.抑制细胞增殖：干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择 性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大500～1000倍。干扰素 抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体 的免疫防御机制限制肿瘤的生长。 3.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬 细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。
药浓度波动，浓度过高时会导致较为严重的不良反应，但浓度过低又 会导致病毒重新复制和反弹；此外，一旦注射了普通干扰素，它广泛 期只有2至5小时，必须频繁注射用药，因而干扰素的临床应用受到了 很大限制。 到1990年代末2000年代之初，聚乙二醇化(PEG)技术的出现使干扰素 终于成为人类与乙肝斗争中的真正利器。2002年，罗氏研究生产的聚 乙二醇化干扰素α-2a(派罗欣)正式上市，聚乙二醇与干扰素的结合， 大大改善了干扰素的药物特性，使血药浓度变得更加稳定，同时聚乙 二醇分子支链对干扰素有效成分的保护作用，大大降低了它的抗原性， 高，副反应显著减少。
基因工程药物——干扰素的制备ppt课件
干扰素发现者Alick Isaacs 1957年，英国医生Alick Isaacs在进行流感病毒试验时，发现鸡胚中注射 灭活流感病毒后生成了一种物质，这种物质具有“干扰”流感病毒感染的作 用，于是Isaacs将这种物质称之为“interferon”，也就是今天我们所说的干 扰素。 干扰素抗病毒作用机理的发现者Robert M.Friedman 在1966到1971年期间，美国医生Robert M.Friedman发现了干扰素对病 毒的抑制作用主要是干扰素干扰了病毒信使RNA功能，而抑制了蛋白的合成。 从此，关于干扰素抗病毒的作用机理的深入研究才被逐渐展开。 干扰素从实验室到临床的重要人物Derek C.Burke 美国病毒学专家Derek C.Burke致力于干扰素的生产流程的研究，并在 1980年实现了通过人类白细胞进行干扰素量化生产，虽然这种生产方式无法 与基因技术出现后的生物工程生产方式相比，但对干扰素从实验室成功地走 向临床却是有着非常重要的意义。 干扰素免疫调节机制的证实者Samuel Baron 美国人Samuel Baron与Isaacs的共同研究证实了干扰素在机体免疫系统对 抗病毒感染中的起着非常重要的作用，也正是他们的研究为干扰素在临床的 应用提供了更多的证据，并为干扰素抗病毒的双重作用机理奠定了基础。 使干扰素的临床应用成为可能Sidney Pestka 美国科学家Sidney Pestka在罗氏研究院里成功克隆出了干扰素cDNA，为 后来干扰素的工业化生产奠定了基础。
早期的干扰素是从人体白细胞中通过纯化技术提取的，不仅量少，且 含有很多杂质，导致作用有限。直到70年代中期，随着生物医学的 发展和基因重组技术的出现，科学家们逐渐开始尝试通过基因重组技 术合成干扰素。1978年，瑞士罗氏公司的科学家帕斯特卡(Pestka) 成功克隆了干扰素cDNA，为后来干扰素的工业化生产奠定了基础。 1990年，基因重组技术正式应用于干扰素的工业化生产，于是今天 所说的“普通干扰素”开始批量生产。但是，普通干扰素也给患者和
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物之干扰素的制备流程课件•引言•基因工程药物制备基础•干扰素制备流程详解•质量控制与安全性评估目•临床应用与市场前景•总结与展望录干扰素的基因克隆与表达目的基因的获取从人或动物细胞中提取干扰素基因，或通过化学合成方法获得。
基因克隆将目的基因插入到合适的载体中，如质粒、病毒等，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入到宿主细胞中，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等，进行基因表达，产生干扰素蛋白。
通过机械、化学或酶解等方法破碎细胞，释放干扰素蛋白。
细胞破碎初步纯化高度纯化利用离心、过滤、层析等技术对干扰素蛋白进行初步纯化，去除杂质和宿主细胞蛋白。
通过高效液相色谱、凝胶过滤层析等技术对干扰素蛋白进行高度纯化，获得高纯度的干扰素制品。
030201干扰素的分离纯化干扰素的制剂与质量控制制剂工艺将纯化后的干扰素蛋白进行制剂加工，如冻干、分装等，制备成适合临床使用的干扰素制剂。
质量控制对干扰素制剂进行质量检测和控制，包括外观、纯度、活性、安全性等方面的检测，确保产品质量符合规定标准。
基因工程药物是指利用基因工程技术生产的药物，包括基因重组蛋白质、基因治疗剂、基因疫苗等。
具有高效、特异性强、安全性高等优点，已成为现代医药产业的重要组成部分。
基因工程药物概述特点定义干扰素介绍定义干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性的蛋白质，是机体天然免疫的重要组成部分。
分类根据结构和功能不同，干扰素可分为α、β、γ等多种类型，其中α-干扰素是临床上应用最广泛的一种。
制备流程研究背景随着重组DNA技术的不断发展，利用基因工程技术生产干扰素已成为可能。
市场需求干扰素具有广泛的临床应用价值，市场需求量大，因此研究其制备流程具有重要意义。
基因重组通过体外DNA重组技术，将目的基因与载体DNA进行切割、拼接，构建重组DNA分子。
基因表达将重组DNA分子导入宿主细胞，利用宿主细胞的转录和翻译系统，表达出具有特定生物学活性的蛋白质分子。
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
纯化方法
采用色谱（如凝胶过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色谱、离子交 换色谱）、电泳等纯化技术，进一步 分离和纯化干扰素蛋白质。
纯度检测
通过SDS-PAGE、高效液相色谱等方 法检测干扰素的纯度，确保产品质量 。
04
干扰素制备过程中的质量控制
工程菌的质量控制
菌种鉴定
确保所使用的工程菌种是正确的，并通过基因测 序等方法进行验证，防止菌种污染或误用。
降低干扰素制备成本的发展需求
原料与耗材的成本控制
在干扰素的制备过程中，原料和耗材的成本占据了很大比例。因此，寻找更经济 、高效的原料来源，以及降低耗材的使用量，是降低成本的重要途径。
生产工艺的优化与改进
通过优化生产工艺，减少生产步骤、提高生产效率，可以降低干扰素的生产成本 。此外，开发连续化、规模化的生产工艺，实现资源的充分利用和能源的高效利 用，也是降低成本的关键。
种类
根据产生来源和受体特异性，干扰素主要分为三类：Ⅰ型干 扰素（包括α和β干扰素）、Ⅱ型干扰素（γ干扰素）和Ⅲ型 干扰素（λ干扰素）。
干扰素的生物学活性
抗病毒活性
干扰素能够抑制病毒的复制和 扩散，通过诱导细胞产生抗病 毒蛋白，降解病毒RNA、阻止 病毒蛋白合成等方式发挥作用
。
抗肿瘤活性
干扰素可以抑制肿瘤细胞的增殖， 诱导肿瘤细胞凋亡，同时激活免疫 系统，增强机体对肿瘤的免疫应答 。
免疫调节活性
干扰素能够调节机体的免疫功能， 激活免疫细胞，增强机体的免疫力 ，从而抵抗病毒和肿瘤的侵袭。
干扰素在医学领域的应用
抗病毒治疗：干扰素已被广泛应用于 病毒感染性疾病的治疗，如乙型肝炎 、丙型肝炎、尖锐湿疣等。
免疫治疗：干扰素可用于免疫调节， 治疗一些自身免疫性疾病和免疫缺陷 病。
基因工程药物之干扰素的制备流程课件
基因工程药物的应用领域
肿瘤治疗
基因工程药物在肿瘤治疗 中发挥了重要作用，如干 扰素、白细胞介素等免疫 调节，基因工 程药物提供了有效的治疗 手段，如囊性纤维化、血 友病等。
抗病毒治疗
针对某些病毒性疾病，基 因工程药物可以起到抗病 毒和免疫调节的作用，如 艾滋病、肝炎等。
干扰素的临床应用与疗效
干扰素在临床上主要用于治疗病 毒性感染、肿瘤以及一些自身免
疫性疾病。
通过注射或雾化吸入给药，干扰 素可有效抑制病毒复制，缓解疾 病症状，提高患者生存率和生活
质量。
然而，干扰素也存在一些副作用 ，如发热、肌肉酸痛、肝肾功能 异常等，需要在医生的指导下合
理使用。
03
基因工程制备干扰素的流程
目的基因的表达
在培养条件下，目的基因在细胞内表达，产生相应的蛋白质或核酸产物。
干扰素的分离纯化
分离方法
采用离心、过滤、萃取等方法，将目 的产物从细胞培养液中分离出来。
纯化方法
通过凝胶电泳、色谱技术（如离子交 换、亲和、排阻等）、超滤等方法， 将目的产物进行纯化。
04
干扰素的质量控制与安全性评 价
。
免疫学评价
检测干扰素对机体免疫系统的影响 ，如免疫原性、抗体产生情况等， 以评估其免疫安全性。
不良反应监测
对临床使用过程中出现的不良反应 进行监测和记录，及时处理并分析 原因，确保患者用药安全。
干扰素的稳定性研究
温度稳定性
研究干扰素在不同温度下的稳定性， 确定其保存、运输和使用的适宜温度 范围。
极具挑战性。
生产成本高
基因工程药物的生产通常需要昂 贵的设备和精细的工艺控制，这 导致了干扰素的生产成本居高不
下。
干扰素生产工艺(共45张PPT)
第二十八页，共45页。
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
第二十九页，共45页。
4 干扰素的别离纯化工艺过程
4.1、干扰素别离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程
第十页，共45页。
免疫调节活性机制
对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
第三十四页，共45页。
〔4〕初级别离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
第三十五页，共45页。
4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装
第十二页，共45页。
1.5.干扰素生产工艺路线〔1〕
基因工程药物之干扰素的制备流程课件(PPT 37张)
3. 干扰素的分离纯化工艺过程
3.1、干扰素分离工艺过程
3.2、干扰素的纯化工艺过程
3.1 干扰素分离工艺过程
菌体裂解
预处理
初级分离
(1)菌体裂解
裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
基因工程菌的制备
目的基因的分离 克隆载体
目的基因与克隆 载体的体外重组
→ 重组体导入大肠杆菌K12
重组质粒
→ 受体菌的培养及筛选→从受体菌中获取目的基因
表达载体
导入大肠杆菌
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
→工
程菌
一、目的基因的分离与扩增
1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶 电泳切取目的基因片段 3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA 4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干 扰素基因的PCR产物 5.人工加尾形成“粘性末端”
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。 一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。 （2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
干扰素制备的工艺流程图
5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
目的基因与克隆载体进行体 外重组
1.提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再 把干扰素基因的PCR产物用相应的 酶酶切,用连接酶连接
2.连接完成后分离纯化,测序,与原干扰 素序列比对。
3.鉴定序列无误后(无义突变也行),导 入受体细胞,筛选
4.菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。进行干扰
素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌 体于一20 ℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。
干扰素发酵过程控制
在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5 小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到 最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆 菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策 略进行过程控制。
干扰素制备的工艺流 程图
干扰素
什么是干扰素?
• 概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因 子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。
• 根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个 类型。
• α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型
(3).pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵 条件所决定。干扰素- α的等电点在pH6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐 受pH2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH,从而造成大量蛋白酶失活减 少干扰素-α的水解，提高干扰素的积累量。
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❖ （4）无菌试验
❖
同半成品。
❖ （5）热原质试验
❖
同半成品检定。
❖
❖ （6）干扰素效价测定
❖
同半成品检定，效价不应低于标示量。
❖ （7）安全试验
❖
取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射
量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚
鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离 克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→ → 受体菌的培养及筛选 从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
→ 导入大肠杆菌 受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
与批之间应一致。
❖ （11）等电点测定 等电聚焦电泳。
❖ （12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质 试验。
成品检定
❖ （1）物理性状
❖
冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得
含有肉眼可见不溶物。
❖ （2）鉴别试验
❖
应用ELISA或中和试验检定。
❖ （3）水分测定
❖
用卡氏法，应低于3%。
❖
人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。15:25:2815:25:2815:2510/24/2020 3:25:28 PM
❖
安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20.10.2415:25:2815:25Oc t-2024- Oct-20
❖
加强交通建设管理，确保工程建设质 量。15:25:2815:25:2815:25Saturday, October 24, 2020
源性DNA应低于100pg。
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。
❖ （10）肽图测定
❖
用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批
四、受ห้องสมุดไป่ตู้菌的筛选
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体 重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆 载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况
五、分析保存
对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。
干扰素的发酵工艺过程
启开种子 精提 冻干
制备种子液 半成品制备
成品检定
❖
专注今天，好好努力，剩下的交给时 间。20.10.2420.10.2415:2515:25:2815:25:28Oct-20
❖
牢记安全之责，善谋安全之策，力务 安全之 实。2020年10月24日 星期六3时25分 28秒Saturday, October 24, 2020
❖
相信相信得力量。20.10.242020年10月 24日星 期六3时25分28秒20.10.24
3.1 干扰素分离工艺过程
❖ 菌体裂解 ❖ 预处理 ❖ 初级分离
(1)菌体裂解
❖ 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） ❖ 使用保护剂：EDTA，PMSF。 ❖ 破碎菌体：2厘米以下的碎块 ❖ 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr ❖ 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。
(2)预处理-沉淀
基因工程药物 --干扰素的制备
1 什么是干扰素
概念(interferon,IFN)：机体 免疫细胞产生的一类细胞因 子，是机体受到病毒感染时， 免疫细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构类似、 功能接近的生物调节蛋白。
根据分子结构和抗原性的差 异分为α、β、γ、ω等4个类 型。
1.1天然干扰素的分类
（4）初级分离
❖ 盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 ❖ 离心：连续流离心机，16000 r/min ❖ 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
3. 2、干扰素纯化工艺过程
❖ 溶解粗干扰素 ❖ 沉淀与疏水层析
阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 ❖ 无菌过滤分装
(1) 溶解粗干扰素
区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。
❖ （5）相对分子量测定
❖
还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相
对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对
分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比
较，误差不得高于10%。
❖ （6）残余外源性DNA含量测定
❖
用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞 争， 严重影响产业的健康发展。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。 （3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。 （4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮 乏。
❖
树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20.10.2420.10.24Saturday, October 24, 2020
❖ 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金 淋巴瘤。
❖ 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） ❖ 多发性硬化症 rhuIFNβ
2 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺
干扰素生产工艺路线
基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:
上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFNα-2a， rhuIFNα-2b； 1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b； 2001－2002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。
EcoR I
BamH I
EcoR I
BamH I
2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选
三、重组体引入宿主细胞
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质 粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件 下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
❖ 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。
❖ 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。
(3)离心
❖ 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min ❖ 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 ❖ 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。
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严格把控质量关，让生产更加有保障 。2020年10月 下午3时 25分20.10.2415:25Oc tober 24, 2020
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作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2020年10月24日星期 六3时25分28秒 15:25:2824 October 2020
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好的事情马上就会到来，一切都是最 好的安 排。下 午3时25分28秒 下午3时25分15:25:2820.10.24
取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏 自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿 制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大 约为30亿~60亿美元。
电泳切取目的基因片段 ❖ 3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA ❖ 4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干
扰素基因的PCR产物 ❖ 5.人工加尾形成“粘性末端”
二、构建重组质粒
❖ 1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因
的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接
提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要）
2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。
❖ 不同来源的干 扰素
1.2 重组干扰素的临床应用
❖ 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。
气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入
发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线
检查，控制杂菌
❖ 3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接 种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转 速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃， pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液 杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至 15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中， 加入冰块使温度迅速降至10℃以下。
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安全在于心细，事故出在麻痹。20.10.2420.10.2415:25:2815:25:28October 24, 2020
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踏实肯干，努力奋斗。2020年10月24日下午3时25分 20.10.2420.10.24
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追求至善凭技术开拓市场，凭管理增 创效益 ，凭服 务树立 形象。2020年10月24日星期 六下午3时25分 28秒15:25:2820.10.24
谢谢大家！
❖ （1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测