鸡蛋溶菌酶提取

鸡蛋溶菌酶提取溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。

主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。

溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。

性质：白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。

稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。

抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。

1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。

通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌作用：溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。

在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。

提取工艺：（一）鸡蛋清中提取溶菌酶方法一——食盐盐析一．材料：原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂）仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机二．工艺流程：原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装三．实验步骤：1选择新鲜鸡蛋，蛋清的pH值不能低于8.0，否则不能用。

2清洗:用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。

3将鸡蛋的两端各敲一个小洞，使蛋清流出。

4用搅拌机搅拌，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止由于起泡引起蛋白质的泡沫变性，而影响溶菌酶活性及产率。

5过滤：用双层纱布将稠度均匀的蛋清过滤，滤除蛋清溶液中的脐带块及蛋壳等。

6加盐：按50:1的比例（NaCl:蛋清液），向蛋清液中加入NaCl细粉，边搅拌边加入促使NaCl细粉及时溶解，以避免NaCl沉于容器底部，而因局部浓度过高而产生大量的白色沉淀7 结晶：用1mod/l的NaOH溶液调节PH为9.5-10.0,边搅拌边加，避免过碱引起蛋白质变性。

于4℃条件下静置过夜，至结晶析出。

为加速其结晶过程，可加入适量溶菌酶晶种（晶种制备：将市售溶菌酶粉剂配制成５％水溶液，每10mL 加入Nacl 0.5g，滴加１Ｍ NaOH溶液调ｐＨ值至9.5—10.0，置4℃冰箱中，结晶析出即成）。

不加晶种两周左右结晶率最高，反之７２—９６ｈ最高。

8结晶过滤或分离：用滤纸或尼龙布过滤，或用离心机离心10min，得到溶菌酶结晶。

9结晶洗涤：用丙酮将溶菌酶结晶洗涤数次（一般3次即可）。

10干燥：将溶菌酶结晶在常温或（50-60）℃条件下干燥制成成品，水分含量质量分数约为（2-3）%。

方法二——离子交换法一．材料原料与试剂：鲜鸡蛋（市售）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、丙酮、724型阳离子交换树脂等，以上药品均为分析纯。

主要仪器：分光光度计（７２３０Ｇ型）、搅拌器（２００～３００ｒｐｍ）、离心机（4000rpm）。

二．工艺流程三．实验步骤１蛋黄与蛋清的分离。

取新鲜的鸡蛋，去壳，经分离器后，使蛋清与蛋黄分离。

打破蛋壳时应避免蛋黄破散，使两者完全分离。

２蛋清的预处理。

将分离后的蛋清加入到搅拌器中，200-300 rpm下搅拌10min，再将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起发泡为宜。

最后用2-3层纱布过滤，以除去残余蛋壳和少量蛋黄。

３吸附。

将过滤后的蛋清冷至５℃后移入搪瓷捅中，然后在搅拌下加入已处理好的树脂（14%加入），使其悬浮在蛋清中，在０～５℃下，搅拌吸附５ｈ，然后在０－６℃静置２０ｈ以上，等分层后，弃去上清液后的树脂用清水反复冲洗２－３次。

以除去杂蛋白，最后晾干树脂，移入一个搪瓷缸中。

４酶的洗脱。

在上述树脂中加入同体积的0.15 mol/L的pH 6.5磷酸盐缓冲液，搅拌洗脱20min，过滤洗脱液，除去一部分杂质。

再重复洗脱２次。

将除去杂质的树脂加入等量浓度为10%的硫酸铵溶液，搅拌洗脱 30min，滤出洗脱液，重复洗脱３次，滤出的洗脱液一起倒入沉淀缸中沉淀。

５沉淀。

在沉淀缸中按洗脱液的体积加入32％固体硫酸铵，搅拌使其溶解，在４℃放置过夜。

第２天，用虹吸法取出上清，4000rpm离心10min分离沉淀物。

６透析。

将沉淀物用蒸馏水全部溶解，然后放入透析袋中，在10℃水中透析过夜，以除去沉淀中的硫酸铵。

收集透析液。

７盐析。

将透析液移入一容器内，用0.1mol/L的NaOH调溶液ｐＨ至８．５~９．０，有白色沉淀时，应立即离心除去沉淀。

用２mol/L HCl调ｐＨ至3.5，搅拌，并在0℃放置４８ｈ，同上离心收集沉淀物。

８成品的干燥。

将上述沉淀物加入到丙酮，搅拌。

放置２ｈ，收集沉淀，用冷冻干燥法干燥沉淀即得产品。

干燥的溶菌酶可在室温下长期保存。

其纯品为白色或微黄色的结晶体或粉末，无臭，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。

方法三——离子交换法一．实验材料鸡蛋（新鲜）磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、氯化钠、丙酮、硫酸铵、724 型阳离子交换树脂等。

二．工艺流程硫酸洗脱蒸馏水，溶解pH=3.5，固体NaCl盐析三．实验步骤（1）树脂处理：将724 树脂先用 w（ NaOH）= 7%的溶液浸泡 2h，滤出树脂凉干，再用 c（HCI）= 0.1moI / L的溶液浸泡 8 h，滤出树脂凉干后，用w（NaCI）= 10% 的溶液浸泡 8 h，滤出树脂凉干备用。

（2）缓冲液配制：取30 . 0 g NaH2 PO4 及 35.8 g Na2 HPO4 溶于 1 L 水中即得 pH = 6.5 的磷酸盐缓冲液。

（3）原料处理：新鲜的蛋清用 pH 试纸测其 pH值应为 8 . 0 左右。

（4）吸附：用冰水冷却并搅拌蛋清，使温度降到5 ℃，缓缓加入 724 型树脂，在不断搅拌下使树脂完全悬浮于蛋清中，保持温度0 ~ 10 ℃ ，继续搅拌 5 h，然后将蛋清在0 ~ 10 ℃静置 12h以上。

（5）洗涤、洗脱：把上层蛋清倾出，下层树脂用清水洗去附着的蛋白质，先后共洗涤四次，最后将树脂滤去水分，用磷酸盐缓冲液分三次加入搅拌，每次搅拌 15 min 后抽滤去水分，然后用ψ（H2 SO4）=1% 的稀硫酸分四次洗脱溶菌酶，合并洗脱液，在洗脱液中加入 w〔（NH4）2 SO4〕=40% 的溶液，析出白色沉淀。

在0 ~ 10 ℃静置 12 h 以上，过滤出沉淀。

（6）透析：将沉淀溶于蒸馏水中，在0 ~ 10 C℃透析 24 h，除去大部分硫酸铵。

（7）盐析：用滴管慢慢加入氢氧化钠溶液， pH 使= 8 . 5 ~ 9 . 0，如有白色沉淀，应即离心除去，然后在搅拌下加入 c（HCI）= 3.0 mOI / L 的盐酸，使溶液 pH= 3.5。

按盐析液的体积缓缓加入 w（NaCI）=5% 的固体氯化钠，则有白色沉淀生成，0 ~ 10 ℃静置 48h，抽滤得到溶菌酶粗品。

（8）精制：将粗品溶菌酶溶入0 ℃无水丙酮中，控制溶液的ρ（粗溶菌酶）= 100 g / L，缓慢搅拌使颗粒松细，在0 ~ 10 C℃静置数小时，滤去丙酮，沉淀真空干燥，即得溶菌酶精品。

如果不用丙酮脱水，将透析液冷冻干燥可得不含氯化钠的溶菌酶。

按蛋清质量计收率为 0.14% 。

方法四——离子交换法（改进工艺）1．将新鲜鸡蛋洗净、控干水、敲破小头、收集蛋清，4℃放置1h以上。

2.724树脂的处理：用1mol/L HCl浸泡树脂2h，用去离子水洗至近中性，再用1mol/L NaOH 浸泡2h ，用去离子水洗至近中性（用过的树脂直接用1mol/L NaOH 浸泡，用去离子水洗至近中性）再用0.15mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液浸泡过夜，滤后备用。

3.吸附。

将冷蛋清加入处理好的 724树脂（每千克蛋清需要未处理树脂160g）大力搅（冰浴中）吸附6h，4℃静置，次日离心（3000r/min，15min），收集树脂，回收蛋清。

4.洗去杂蛋白。

树脂先用去离子水洗至洗液无浑浊，再用等体积的0.15mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液搅拌洗涤20min（冰浴下）搅拌洗涤应重复 2次，最后1次滤除树脂水分。

5. 洗脱溶菌酶。

树脂用等体积的10%的（NH4）2SO4浸泡，4℃下过夜，次日搅拌30min，洗脱液经尼龙布过滤，准确量取体积。

再加入体积10%的（NH4）2SO4重复洗脱2次，合并洗脱液。

6.盐析溶菌酶。

每83ml洗脱液加32g磨细的固体（NH4）2SO4，在搅拌下缓慢加入，待（NH4）2SO4完全溶解后，4℃放置过夜。

次日，离心（3000r/min，15min），收集沉淀。

7.透析除盐。

将盐析沉淀装入透析袋，用蒸馏水透析24h以上，其间换2次蒸馏水。

8. 去杂质。

取出透析袋中的透析液，用 2mol/L HCl调整pH4.6，离心，收集上清液。

其沉淀加少量蒸馏水（约为沉淀的5倍）搅匀，再重复处理 2次。

合并上清液、调整pH5.5，再加,1mol/L NaHPO4—KH2PO4 缓冲液（pH5.5）,达终浓度为10mmol/L，静置10min、离心、弃沉淀，收集纯化液。

9.浓缩与干燥。

纯化液在（40±2）℃真空旋转蒸发，变浊时倒出、冷冻，室温真空干燥。

方法五——阳离子交换法一．实验材料1.阳离子交换树脂（７３２）树脂，聚丙烯酰胺凝胶（ｓＤｓ—ＰＡＧＥ）2.乙酸和配缓冲液用的磷酸钠与氢氧化钠等试剂均为分析纯（ＡＲ级）。

3.鸡蛋从自由市场上随机购买，新鲜无异常。

二．实验步骤1按照国家有关标准方法配置ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９的四种磷酸缓冲液。

2鸡蛋清样品处理方法去蛋壳，手工分离得鸡蛋白，分别加ｐＨ６到ｐＨ９的缓冲液充分浸泡蛋白，均质处理上述缓冲液处理过的蛋白液（四种磷酸缓冲蛋白液）。

3 分离层析柱制备及溶菌酶分离方法７３２树脂经多重蒸馏水处理后，小心灌人1X30 cm的柱中，再以ＰＨ６到９的缓冲液分别洗涤，制得四种缓冲能力的７３２树脂分离柱。

将上述四种磷酸缓冲蛋白液分别移入相应ｐＨ值缓冲液处理过的分离柱，以相应缓冲液洗脱一定时间后，再以0.1 mol/L的乙酸洗脱，在整个洗脱过程中，洗脱液每10 ml收集一管，收集到的洗脱液立即经280nm检验溶菌酶和其它杂蛋白的洗脱顺序。