超分辨远场生物荧光成像_突破光学衍射极限_毛峥乐
光学衍射极限的突破
光学衍射极限的突破纪岚森，仵云龙，李岷池，贺杰（青岛大学物理科学学院2011级材料物理1班）摘要：由于光学衍射极限的存在，使得在电子科技上边很难达到人们期望的高分辨率，然而光学衍射极限并不是不能克服的。
除了减小光波长与增加孔径外，我们还可以通过改变光路来突破艾里斑衍射极限。
减小艾里斑在很多的方面都有极其重要的意义，这里讲述的是艾里斑对显微镜技术突破的一些介绍。
关键词：艾里斑，显微镜，光学衍射极限1引言：在大量的电子图像应用领域，人们经常期望得到高分辨率（简称HR）图像。
高分辨率意味着图像中的像素密度高，能够提供更多的细节，而这些细节在许多实际应用中不可或缺。
例如，高分辨率医疗图像对于医生做出正确的诊断是非常有帮助的；使用高分辨率卫星图像就很容易从相似物中区别相似的对象；如果能够提供高分辨的图像，计算机视觉中的模式识别的性能就会大大提高。
同时随着生命科学的迅猛发展三维光学显微技术也已经成为研究生命过程的一种极为有效的工具，但是传统的基于荧光共焦技术的成像方案受到光学衍射极限的限制，其横向和纵向的数量级均在百纳米，因而无法满足科学技术发展的需要，利用各种非线性光学荧光激发方案已经打破光学极限的方案已经实现，然而这种光路较为复杂，通过其他的方法构造出来的奇异光线也是能够实现科学家长期最求的三维远场光学的超分辨成像。
根据瑞利衍射极限任意的光学系统成像就会在像方产生一个光斑，而这个光斑是无法通过改变显微镜的结构来实现的，也就是说，无论是共焦显微镜或是宽场显微镜这个光斑都是存在的，而这个光斑就是我们所说的爱里斑(Airy disc) 由于光的波动性，光通过小孔会发生衍射，明暗相间的条纹衍射图样，条纹间距随小孔尺寸的减少而变大。
大约有84%的光能量集中在中央亮斑，其余16%的光能量分布在各级明环上。
衍射图样的中心区域有最大的亮斑，称为爱里斑。
爱里斑的角度与波长(λ)及小孔的直径(d)满足关系：sinθ=1.22λ/d，θ即第一暗环的衍射方向角（即从中央亮斑的中心到第一暗环对透镜光心的张角），因为θ角一般都很小，有sinθ≈θ，故θ≈1.22λ/d。
近代显微成像技术的研究进展与应用
近代显微成像技术的研究进展与应用狄伶【摘要】The development of microscope imaging technology was introduced, and the imaging principle and application of fluorescence microscopy, confocal microscopy and super-resolution microscopy were outlined. The technology of stimulated emission depletion (STED) was clarified in the super-resolution microscopy. With the rapid development of computer technology and photo-electricity technology, a new generation of microscopy of living cells is developed, and cells tracking, real-time observation, 3D reconstruction, fluorescence quantification and four-dimensional dynamic analysis can be carried out at molecular and ion levels.%本文简述显微成像技术的发展历史,介绍荧光成像、共聚焦显微成像和超分辨显微成像技术的工作原理及应用.超分辨显微成像技术中主要介绍受激发射损耗技术.随着计算机技术和光电技术的飞速发展,新一代显微成像技术对活细胞微观生命活动实现了分子和离子水平的形态定位、实时动态观察、三维结构重组、荧光定量分析和四维动态分析.【期刊名称】《中国医疗设备》【年(卷),期】2018(033)002【总页数】4页(P107-110)【关键词】显微成像技术;共聚焦显微镜;受激发射损耗;超分辨显微成像技术【作者】狄伶【作者单位】上海交通大学分析测试中心,上海 200240【正文语种】中文【中图分类】TH74引言显微成像技术是一种借助物理方法观察微小物体的技术手段，它的发展与物理学领域对光的认识密不可分。
达到光学分辨率极限的“最清晰”图像问世
达到光学分辨率极限的“最清晰”图像问世
佚名
【期刊名称】《创新时代》
【年(卷),期】2012(000)009
【摘要】英国《自然·纳米技术》杂志8月12日在线刊登报告说，新加坡研究人员完成了一幅常用作图像测试的彩色女子头像“莱娜”，整幅头像大小只有50微米见方，它的清晰程度可达到光学分辨率的理论极限，即化每250纳米距离上安放一个像素点。
【总页数】1页(P15-15)
【正文语种】中文
【中图分类】TP334.22
【相关文献】
1.雾天车辆超分辨率视频图像清晰度识别仿真 [J], 汤嘉立;杜卓明
2.基于块旋转和清晰度的图像超分辨率重建算法 [J], 尧潞阳;解凯;李桐
3.达光学分辨率极限“最清晰”图像问世 [J], W．KJ
4.每250nm距离安放一个像素点达光学分辨力极限的“最清晰”图像问世 [J],
5.达到理论极限的带光学读出的非致冷焦平面列阵 [J], 高国龙
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
超分辨荧光显微技术原理
2014 年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。
也许接下来的几天，媒体会关注 Stefan Hell、Eric Betzig 二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。
但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。
这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题：1. 为什么需要（光学）显微技术？2. 为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？3. 用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”？为什么这个理论极限可以被突破？5. 为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？1. 采样定理与显微镜我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。
那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。
比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为 5 微米。
而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即 10 微米。
再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛 25 厘米的位置，我们能分辨物体上相距为 80 微米的两个点，换算成点阵密度就是大约 320 ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。
如果要观察小于 80 微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。
现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。
按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为 200 纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的 sCMOS 相机（每个感光像素尺寸为 6.5 微米），只需要使用放大倍率为 65 倍的物镜就足够了。
STED超分辨成像技术
STED超分辨成像技术超分辨光学成像超分辨光学成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限（200nm）的显微镜，技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。
简介光学显微镜凭借其⾮接触、⽆损伤等优点，长期以来是⽣物医学研究的重要⼯具。
但是，⾃1873年以来，⼈们⼀直认为，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm，⽆法⽤于清晰观察尺⼨在200 nm以内的⽣物结构。
超分辨光学成像(Super-resolution Optical Microscopy)是本世纪光学显微成像领域最重⼤的突破，打破了光学显微镜的分辨率极限（换⾔之，超越了光学显微镜的分辨率极限，故被称为超分辨光学成像），为⽣命科学研究提供了前所未有的⼯具。
光学显微镜的分辨率1873年，德国物理学家恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)提出，光学显微镜受限于光的衍射效应和光学系统的有限孔径，存在分辨率极限（也称阿贝极限），其数值约为l / 2NA（分辨率极限公式），其中l是光波波长，NA是光学系统的数值孔径（Numerical Aperture）。
, n为介质的折射率，a为物镜孔径⾓的⼀半。
成像时若使⽤波长为400 nm的光，并采⽤空⽓（折射率为1）作为物镜和样本之间的介质，可计算得到分辨率极限为200 nm。
因此，我们通常说，光学显微镜的分辨率极限约为200 nm。
此后的研究表明，光学显微镜的分辨率决定于光学系统中聚焦光斑（称为艾⾥斑, Airy disc）的尺⼨。
另外，当⼀个艾⾥斑的边缘与另⼀个艾⾥斑的中⼼正好重合时，此时对应的两个物点刚好能被⼈眼或光学仪器所分辨（这个判据称为瑞利判据，Rayleigh Criterion）。
利⽤瑞利判据以及艾⾥斑的数学表达式，我们可以得到光学显微镜的分辨率公式：0.61λ/NA。
值得指出的是，光学显微镜的分辨率公式跟前⾯提到的分辨率极限公式有所不同，⽽前者更⼴泛的被光学成像领域使⽤。
基于随机采样的快速超分辨荧光成像技术研究及其样机实现
.86中国医疗器械信息 | China Medical Device Information行业报道Industry Report光学显微成像技术具有无损、非接触、高特异性、高灵敏、高活体友好以及能够提供功能信息等突出优点，在生物医学和材料科学领域有广泛的应用。
并且由于其具有三维层析成像能力，可借助荧光标记等其他技术手段对于样品内部的结构和生化反应进行针对性的观察，是获知生物体结构、形貌以及临床医学诊断等领域非常重要的工具。
近年来随着生命科学和临床医学的发展，迫切需要一种既具有纳米尺度的光学分辨本领，还可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构、功能的演化，同时不影响生物体系生物活性的光学成像显微技术。
然而传统光学显微成像技术的空间分辨率受衍射极限的限制，无法做到小于200nm 分辨率，只能观测到微米至亚微米级的结构形貌。
为了突破光学显微成像技术的衍射极限，科学家不断地寻找新的方法来提高显微成像技术的分辨率。
1957年，Marvin Minsky 在哈佛大学最早提出了共聚焦（Confocal ）的概念，并对载物台扫描共聚焦显微镜申报了美国国家专利（US Pat. 3013467）。
1987年出现了第一台激光扫描共聚焦显微镜商业产品。
至此，共聚焦显微技术已基本发展到比较成熟的阶段。
然而，共焦显微镜的分辨率只是在宽场显微镜上提升约1.4倍，仍然不能突破光学衍射极限。
近年来，Stefan W. Hell 等人[1,2]提出的STED 和基态倒空（Ground state depletion ，GSD ）荧光成像技术，庄小威等人[3]提出的STORM 技术，Eric Betzig 等人[4]和Samuel T. Hess 等人[5]提出的光激活定位超分辨成像方法（Photo-activated localization microscopy ，PALM ），突破了光学衍射极限的限制，使光学显微镜的成像分辨能力提高到几十纳米。
超分辨率荧光显微技术——2014年诺贝尔化学奖
在 神经生 物 学 研 究 中 ， 利用 ３ Ｄ多色 Ｓ ＴＯ ＲＭ 技 术
观 测蛋 白在 轴 突 中 的结 构变 化 ］ ， 深 入 了解 神 经 细 胞 的“ 动 态” ， 对 帕金森 氏 作用 。
第 ４期
化
学
世
界
纳米 大小 体积 的荧 光 区域 ， 通 过 扫 描 实现 超 高 分 辨
率 的图像 ， 获得 了尺寸小 于０ ． ２ 微 米 的 分 辨 图 。埃 里
超 分 辨 率 荧 光 显 微 技 术
一
克 ・白兹 格是 荧 光 显微 技 术 领 域 的 领军 人 物 ， １ ９ ９ ２
显 微镜 难 以突破 的瓶 颈 。 自 ２ Ｏ世 纪 八 九 十 年 开 始 ，
小 的分子 间相 互作 用组 装成 细胞 微管 、 肌丝 、 中间丝
这些 超过 １ ０ Ｆ ｍ 大小 聚合 物 的 机 制 ］ 。此 外 这 种
技术 还可 与 活 细胞 成 像 技 术 和 单 分 子 示 踪 技 术 结 合， 获得 蛋 白质簇 动态 的统计 数据 和形 态学 数据 ， 从 而 帮助 了解蛋 白质 动态 组装 的机 制 。如在病 毒研 究
学 显微镜 的极 限 ， 借 助 荧 光分 子 使 光 学 显 微 镜 分辨 率 达到 纳米 级 ， 让 人 类 能 够 实 时看 到单 个 分 子 在化
学 系统 里 的活动 ， 为揭 示催 化作 用 、 生 物学 和材 料科
学 中的基本 的化 学 和 生化 反 应 过 程 ， 更 好 地 认 识世 界 奠定 了基 础 ， 这 对 化 学 和 生 化 学 界 而 言 是 重 要 的 创新。 １ 超 分 辨 率 荧 光 显 微 技 术 的 发 展
突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展 (修改)
结课论文题目突破衍射极限得超高分辨率成像得技术进展学生姓名学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久得历史,但一直以来，光学成像一直受到衍射极限得限制而分辨率无法突破２0０nm.后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,但就是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。
值得庆贺得就是近年来，超高分辨率显微技术得发展使得光学显微成像分辨率达到了2０nm以下。
其中德国科学家Stｅfａn Helｌ、美国科学家ErｉｃＢetzig与Wiｌｌiam Mo ｅｒｎer因其在超高分辨率显微技术方面得突出贡献获得了2014年得诺贝尔化学奖。
在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术得发展与应用,并对诸位大师致以敬意.1.2 技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y 平面分辨率与Ｚ轴分辨率大小来判定,分辨率越高数值越小.下表就是各种显微成像技术得分辨率指标。
二 衍射极限2、1 衍射极限我们能瞧到什么?瞧到多小得范围?瞧得有多清楚？几百年来,依靠不断进步得科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以瞧得越来越“小”,进而可以进行研究。
人得肉眼能分辨0、１毫米尺度得物体，再小，就要借助工具。
1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究得光学显微镜,用它观察薄薄得软木塞切片。
虎克瞧到了残存得植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起,这就就是“细胞”一词得由来。
此后，显微镜制造与显微观察技术得迅速发展,帮助科学家第一次发现了细菌与微生物。
那么,光学显微镜就是否可以无止境地“放大"下去，让我们想瞧到多小就能瞧到多小？科学家为成像技术 Ｘ-Ｙ平面分辨率(ｎm) Z 轴分辨率(n ｍ) 普通光学显微镜 2０0－30０ 5０0—７0０4Pi 显微镜 1００-15０STED 显微技术 50—70 ST ＥD ＋４技术 50 50 ＰAL Ｍ技术 20 3０ 3D ST ＯＲM 技术 20—3０ 50—6０ ｄSTORM 技术 30 50 2D SSI Ｍ技术 ５0 3Ｄ SSI Ｍ技术 100 2０0 电子显微镜 ０、０5 X 光衍射仪 0、0３—10此做了很多尝试，最终发现,存在一道法逾越得“墙"—衍射极限.ﻫ 1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光就是一种电磁波,由于存在衍射，一个被观测得点经过光学系统成像后，不可能得到理想得点，而就是一个衍射像，每个物点就像一个弥散得斑,如果这两个点靠得很近,弥散斑就叠加在一起，我们瞧到得就就是一团模糊得图像。
光学工程中超分辨成像技术的研究与应用
光学工程中超分辨成像技术的研究与应用在今天科学技术日新月异的时代，光学成像技术更是朝着高清晰度、高精确度、高速度的方向不断发展，而超分辨成像技术作为光学成像技术的高端产品，一直备受科学家和工程师的重视和研究。
本文将从基本原理到应用实践，全面介绍超分辨成像技术的研究和应用。
一、超分辨成像技术的基本原理超分辨成像技术是指利用一些特殊的成像原理或者技术手段，将物体的微小细节信息呈现出来，从而达到超越传统光学分辨极限的图像清晰度和精确度。
在光学领域，超分辨成像技术最核心的原理就是“突破衍射极限”。
1. 衍射极限的基本概念在光学领域，衍射极限是指在理想条件下，可分辨两个形态不同但空间位置非常近的物体时，两者之间的最小距离，也叫做“最小可分辨距离”。
在底片放大成像时，这个距离通常被表示为空间频率（即一个典型的线数/mm）。
根据基本物理原理，可分辨距离的最小值约等于半个光波长。
2. 突破衍射极限的方法为了实现超越传统光学分辨极限的图像清晰度和精确度，科学家和工程师们通过各种手段来突破衍射极限，如：（1）双光子激发显微术（TPM）：这种技术是基于二次激光的原理，通过激发样本的荧光信号，在三维空间内重建出样本的一个高分辨率的图像。
（2）双片方法：双片方法利用一种迭代算法来分析和优化成像系统中的点扩散函数，从而超越传统光学分辨极限。
这种方法通常需要校准成像系统的点扩散函数，因此对计算机和软件的要求比较高。
（3）固体光学自旋陀螺磁共振成像（SOLID）：这种技术结合了光学和磁共振成像的优点，可以在超过传统光学分辨极限的情况下对样品进行高精度成像。
（4）单分子荧光成像：这种方法可以实现单个分子的成像，可以用来研究生物分子之间的相互作用和位置关系。
二、超分辨成像技术的应用实践超分辨成像技术在生物学、材料科学、化学等领域有着广泛的应用，可以为研究者提供更加全面、高清晰的实验数据和结果。
下面将介绍超分辨成像技术在这些领域的应用实践。
超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究说明书
第26卷 第12期2014年12月V ol. 26, No. 12Dec., 2014生命科学Chinese Bulletin of Life Sciences文章编号：1004-0374(2014)12-1255-11DOI: 10.13376/j.cbls/2014181收稿日期：2014-12-01*通信作者：E-mail:**************.cn超高分辨率显微镜推进纳米生物学研究任煜轩*，于 洋，王 艳(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心·上海(筹)，上海 201210)摘 要：超高分辨率显微镜是近年来生命科学领域重要的研究手段之一。
2014年诺贝尔化学奖颁发给超高分辨率显微技术领域的三位科学家，以表彰他们在该领域所作出的杰出贡献。
超高分辨率技术的典型代表有受激损耗、结构光照明以及单分子定位等。
这些技术的出现使得传统光学显微镜难以分辨的细胞器、分子等细节信息可以被观察到，帮助科学家从纳米尺度认识细胞内分子结构、定位以及相互作用。
关键词：超高分辨率；受激损耗；结构光照明；光敏定位；随机光学重构中图分类号：Q-336 文献标志码：A Super-resolution microscopy in NanobiologyREN Yu-Xuan*, YU Yang, WANG Yan(National Center for Protein Sciences Shanghai, Institute of Biochemistry and Cell Biology,Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China )Abstract: Super-resolution microscopy is one of the advanced means for the study of life sciences. The 2014 Nobel prize in Chemistry was awarded to three scientists for their contributions to the super-resolution microscopy. Representative techniques achieving super-resolution are stimulated-emission, structured-illumination, and single-molecule localization. The advancement of these techniques enable the visualization of the detail in cell organelle, macromolecules, and the localization of molecules. Such kind of information was unresolvable under traditional optical microscopes and will help understand the structure, location, interaction of molecules within cells in nanometer scale.Key words: super-resolution; stimulated emission depletion; structured illumination; photo-activation localization; stochastic optical reconstruction生命科学处处充满着神奇。
光学超分辨突破光学衍射极限的挑战
光学超分辨突破光学衍射极限的挑战光学超分辨技术一直以来都面临着一个重大挑战，即光学衍射极限的限制。
根据光学原理，当物体的尺寸小于光波的波长时，光学显微镜无法观察到其细节。
然而，随着科技的不断发展，人们对于超越光学衍射极限的需求也越来越迫切。
在近年来，随着光学超分辨技术的不断突破，一种全新的视野正在展开。
光学超分辨技术的突破主要依赖于两种关键技术，即近场光学显微镜和荧光标记。
1. 近场光学显微镜近场光学显微镜是一种能够绕过光学衍射极限的显微镜技术。
光学显微镜为我们提供了观察微观世界的途径，然而，其分辨率一直受到限制。
近场光学显微镜通过在物体和探测器之间引入纳米刻度的探测器探头，使得探测器能够接近或直接接触被观察物体表面，从而绕过了光学衍射极限。
这种技术的发展极大地拓宽了我们对微观领域的认知。
2. 荧光标记技术荧光标记技术是另一种突破光学衍射极限的重要技术。
利用荧光标记，科学家们能够将荧光标记剂附着在被观察对象的表面或内部，从而对其进行标记。
这些荧光标记剂能够发光，并且能够通过特定的光源进行激发。
通过对荧光标记的观察和分析，科学家们能够获得超过光学衍射极限的分辨率。
这一技术的应用广泛，涵盖了生物医学研究、纳米材料研究等领域。
然而，值得注意的是，光学超分辨技术的突破并非毫无限制。
其存在一定的条件限制和技术难题。
例如，对于近场光学显微镜来说，由于纳米刻度探测器的制造和操作难度较大，其运用仍面临挑战。
同时，荧光标记技术也需要克服标记剂的选择、标记过程的可靠性等问题。
对于这些挑战，科学家们正在不断探索和研究，以期开拓更广阔的研究领域并提出更有效的解决方案。
总结而言，光学超分辨突破光学衍射极限的挑战是一个具有挑战性和前瞻性的课题。
通过近场光学显微镜和荧光标记技术的应用，科学家们正在突破光学衍射极限，实现对微观领域的更细致观察和研究。
尽管还存在一些技术难题，但相信在不久的将来，光学超分辨技术将会得到更为广泛的应用，为科学研究和各个领域的发展带来新的突破。
超分辨显微镜的工作原理与成像技术
超分辨显微镜的工作原理与成像技术超分辨显微镜是一种先进的光学显微镜，具有很高的分辨率和成像能力，可以观察到微观领域中细小的结构和现象。
本文将介绍超分辨显微镜的工作原理和成像技术，以及其在生物医学、材料科学和纳米技术等领域的应用。
一、工作原理超分辨显微镜的工作原理基于曲折规律和波的衍射。
传统光学显微镜由于照明光束的衍射限制，无法分辨出比光的波长还要小的物体细节。
而超分辨显微镜通过使用特殊的技术，克服了这一限制。
1.1 衍射极限传统光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制。
衍射极限（称为耐克斯特准则）是由德国物理学家安德烈亚斯·耐克斯特提出的，规定了光学系统能够分辨物体的最小尺寸，即0.61倍的照明光波长。
超过这个极限，显微镜就无法分辨出物体的细节。
1.2 超分辨技术超分辨显微镜采用了多种技术来突破衍射极限，实现更高的分辨率。
其中最常见的技术包括：1.2.1 利用荧光标记超分辨显微镜可以通过利用荧光标记结合合适的成像技术，将被观察物体的特定部分标记出来，并对其进行成像。
这些标记物在光的刺激下会发出荧光信号，通过检测和分析这种信号，可以实现纳米级的分辨率。
1.2.2 利用近场效应近场光学显微镜利用装载在探针尖端的金属纳米结构，利用探针与样品之间的极短距离来增强照明光的局部电场，从而实现超分辨成像。
这种技术在表面等离子激元共振和原子力显微镜中得到广泛应用。
1.2.3 利用建构性干涉通过将两束光进行干涉，可以在显微镜中形成特定的干涉模式。
这种模式包含了被观察物体的高频细节信息。
运用适当的算法和数学处理，可以从干涉模式中提取出高分辨率的图像。
二、成像技术超分辨显微镜采用多种成像技术来获取高分辨率图像。
以下是几种常用的成像技术：2.1 结构光成像结构光成像利用相干光束通过物体表面，通过记录物体与光束的相互作用，实现高分辨率的三维成像。
利用这种技术，可以获得具有亚微米分辨率的物体表面拓扑图像。
2.2 荧光成像荧光成像是利用带有荧光标记的样品在激发光线照射下发出的荧光信号进行成像。
生物背景下的荧光染料标定与成像技术研究
生物背景下的荧光染料标定与成像技术研究荧光染料标定与成像技术在生物科学领域中扮演着重要的角色。
这些技术通过将荧光染料应用于生物样品的成像过程中，帮助研究人员观察和分析细胞、组织和器官的结构和功能。
在本文中，我们将重点研究生物背景下荧光染料标定的方法和成像技术的发展。
荧光染料标定是确保成像实验结果准确性和可重复性的重要步骤。
在荧光成像中，荧光染料的标定能够提供关于荧光强度和荧光信号的定量信息。
当荧光染料与生物样品结合时，其吸收和发射光谱会受到样品内生物分子、杂质、自发荧光等因素的干扰。
因此，标定过程需要消除这些干扰因素，以保证测量结果的准确性。
目前，常见的荧光染料标定方法包括基于标准物质和基于内部参考的方法。
基于标准物质的方法通过使用已知浓度和荧光强度的标准染料溶液进行荧光标定。
由于标准物质的浓度和荧光强度已经被准确确定，因此可以根据标准物质和未知样品的比较来推断未知样品的浓度和荧光强度。
这种方法简单易行，但需要选择合适的标准物质和条件，并进行准确的测量和计算。
基于内部参考的方法通过引入内部参考物质来校正荧光信号。
内部参考物质被认为是不受生物样品影响的物质，其荧光强度保持稳定。
通过测量生物样品和内部参考物质的荧光信号，可以获得相对荧光强度。
这种方法可以减小样品之间的误差，并提高测量的准确性。
然而，内部参考的选择和验证需要进行严格的实验和分析。
除了荧光染料标定，成像技术的发展也在不断提高荧光成像的分辨率、对比度和灵敏度。
随着近几十年来生物光学成像技术的快速发展，新一代的高分辨率荧光显微镜已广泛应用于生命科学研究领域。
这些成像技术包括共聚焦显微镜、多光子显微镜和超分辨显微镜等。
共聚焦显微镜是最常用的荧光成像技术之一。
它通过使用点光源扫描样品来获得图像。
与传统的广场扫描显微镜相比，共聚焦显微镜可以减少背景噪声和增加成像的分辨率，从而获得更清晰的图像。
多光子显微镜是一种基于非线性光学过程的成像技术。
与单光子显微镜不同，多光子显微镜使用高能量、低频率的激光束来激发样品中的荧光染料。
超分辨远场生物荧光成像_突破光学衍射极限_毛峥乐
第35卷 第9期2008年9月中 国 激 光C H IN ESE J OU RNAL O F L ASERSVol.35,No.9September ,2008 文章编号:025827025(2008)0921283225超分辨远场生物荧光成像———突破光学衍射极限毛峥乐 王 琛 程 亚(中国科学院上海光学精密机械研究所强场激光物理国家重点实验室,上海201800)摘要 长期以来,远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤、可探测样品内部等优点,一直是生命科学中最常用的观测工具。
但由于衍射极限的存在,使传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm 和1000nm 。
为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征,提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求,在远场荧光显微镜的基础上,科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨率极限的成像技术。
例如,采用横向结构光照明提高横向分辨率到约100nm ,利用纵向驻波干涉效应将纵向分辨率提高5～10倍。
然而,直到在光学荧光显微镜中引入非线性效应后,衍射极限才被真正突破,如受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了30～50nm 的三维分辨率。
另外应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限,甚至可以将分子定位精度提高到几个纳米的量级。
关键词 光学;超分辨;远场光学荧光显微镜;生命科学;非线性效应;单分子中图分类号 T H742.65 文献标识码 A doi :10.3788/C JL20083509.1283Superresolution F ar 2Field Fluorescence Bio 2Imaging :B reaking the Diffraction B arrierMao Zhengle Wang Chen Cheng Ya(S tate Key L aboratory of Hi gh Fiel d L aser Physics ,S hanghai I nstitute of O ptics andFine Mechanics ,Chinese A cadem y of Sciences ,S hanghai 201800,China )Abstract Far 2field optical fluorescence microcopy has become an essential tool in life science for a long time largelyowing to its unique capability to provide noninvasive ,three 2dimensional (3D )imaging inside cells.However ,resolution of a traditional wide 2field optical microscopy is limited to about 230nm laterally and 1000nm axially ,due to the diff raction 2limit of light.Resolution improvement is urgently demanded because molecule 2scale dynamics and structures are to be revealed inside living cells in today ’s life science.So far ,many scientists have proposed a significant amount of novel methods in order to enhance resolution of far 2field optical imaging.For example ,lateral resolution of approximately 100nm has been achieved by use of structured illumination ,whereas the axial resolution has been enhanced 5～102fold using a standing wave produced by two beams propagating in opposite directions.Nevertheless ,diffraction barrier was not broken in these cases until nonlinear optical effects were introduced into optical fluorescence microscopy.As an example ,the use of a nonlinear optical effect ,namely ,simulated emission depletion microscopy has resulted in a 3D resolution of 30～50nm.Furthermore ,the barrier of diff raction 2limit can also be broken by novel technologies based on fluorescence resonance energy transfer and high 2accuracy localization of fluorophores ,by which molecules can be positioned with a resolution of several nanometers.K ey w ords optics ;superresolution ;far 2filed optical fluorescence microscopy ;nonlinear optical effects ;single molecule 收稿日期:2008203207;收到修改稿日期:2008206204 作者简介:毛峥乐(1982—),男,上海人,硕士研究生,主要从事生物荧光成像方面的研究。
光学超分辨荧光显微成像--2014年诺贝尔化学奖解析
光学超分辨荧光显微成像--2014年诺贝尔化学奖解析纪伟;徐涛;刘贝【摘要】Super-resolution fluorescent microscopy becomes a powerful tool for biomedical research, and extent the application of fluorescent microscopy to a brand new level. The Royal Swedish Academy of Sciences decided to award Erik Betzig, Stefan W. Hell and W. E. Moerner the Nobel Prize in Chemistry 2014 for the development of super-resolution fluorescence microscopy. Their award proved the importance of this multidisciplinary field consist of chemistry, biology and physics. In this article, we briefly introduced the historical background of super-resolution imaging, and dissect the born and development of each techniques. Finally, the current problems and the challenges for future research were presented.%超分辨成像显微镜的出现为现代生物医学研究提供了新的强有力的工具，将荧光显微镜的应用推到了新的高度。
2014年诺贝尔化学奖授予了Eric Betzig、Stefan Hell以及William Moerner三位科学家，以表彰他们在“发展超高分辨荧光显微镜”上的贡献。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第35卷 第9期2008年9月中 国 激 光C H IN ESE J OU RNAL O F L ASERSVol.35,No.9September ,2008 文章编号:025827025(2008)0921283225超分辨远场生物荧光成像———突破光学衍射极限毛峥乐 王 琛 程 亚(中国科学院上海光学精密机械研究所强场激光物理国家重点实验室,上海201800)摘要 长期以来,远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤、可探测样品内部等优点,一直是生命科学中最常用的观测工具。
但由于衍射极限的存在,使传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm 和1000nm 。
为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征,提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求,在远场荧光显微镜的基础上,科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨率极限的成像技术。
例如,采用横向结构光照明提高横向分辨率到约100nm ,利用纵向驻波干涉效应将纵向分辨率提高5～10倍。
然而,直到在光学荧光显微镜中引入非线性效应后,衍射极限才被真正突破,如受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了30～50nm 的三维分辨率。
另外应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限,甚至可以将分子定位精度提高到几个纳米的量级。
关键词 光学;超分辨;远场光学荧光显微镜;生命科学;非线性效应;单分子中图分类号 T H742.65 文献标识码 A doi :10.3788/C JL20083509.1283Superresolution F ar 2Field Fluorescence Bio 2Imaging :B reaking the Diffraction B arrierMao Zhengle Wang Chen Cheng Ya(S tate Key L aboratory of Hi gh Fiel d L aser Physics ,S hanghai I nstitute of O ptics andFine Mechanics ,Chinese A cadem y of Sciences ,S hanghai 201800,China )Abstract Far 2field optical fluorescence microcopy has become an essential tool in life science for a long time largelyowing to its unique capability to provide noninvasive ,three 2dimensional (3D )imaging inside cells.However ,resolution of a traditional wide 2field optical microscopy is limited to about 230nm laterally and 1000nm axially ,due to the diff raction 2limit of light.Resolution improvement is urgently demanded because molecule 2scale dynamics and structures are to be revealed inside living cells in today ’s life science.So far ,many scientists have proposed a significant amount of novel methods in order to enhance resolution of far 2field optical imaging.For example ,lateral resolution of approximately 100nm has been achieved by use of structured illumination ,whereas the axial resolution has been enhanced 5～102fold using a standing wave produced by two beams propagating in opposite directions.Nevertheless ,diffraction barrier was not broken in these cases until nonlinear optical effects were introduced into optical fluorescence microscopy.As an example ,the use of a nonlinear optical effect ,namely ,simulated emission depletion microscopy has resulted in a 3D resolution of 30～50nm.Furthermore ,the barrier of diff raction 2limit can also be broken by novel technologies based on fluorescence resonance energy transfer and high 2accuracy localization of fluorophores ,by which molecules can be positioned with a resolution of several nanometers.K ey w ords optics ;superresolution ;far 2filed optical fluorescence microscopy ;nonlinear optical effects ;single molecule 收稿日期:2008203207;收到修改稿日期:2008206204 作者简介:毛峥乐(1982—),男,上海人,硕士研究生,主要从事生物荧光成像方面的研究。
导师简介:程 亚(1971—),男,上海人,研究员,博士生导师,长期从事飞秒激光与物质相互作用、飞秒三维生物成像及飞秒三维微加工研究。
E 2mail :ycheng 245277@ (通信作者)1 引 言1.1 生命科学与光学显微镜毫无疑问,纳米技术与生物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。
纳米技术应用广泛,包括1～100nm 尺度内的成像、测量、加工、操纵等。
如图1所示[1],许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内,研究这些微生物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展,反过来,超分辨显微术的发展也推动了整个生命科学的进步。
图1自然界微生物尺度Fig.1Size of microorganisms in nature 光学显微镜的发展伴随着人类对微观世界探索的历程。
早在公元前一世纪,人们就发现透过水滴可以观察到物体放大的像。
1590年前后,荷兰透镜工匠Z.J anssen 和他的儿子把透镜组安装在管中,发明了原始的光学显微镜。
在此之后,Anton van Leeuwenhoek 和R.Hooke 对成像原理进行深入的研究,改进和发明了显微镜各部分结构,包括调焦结构、照明系统和载物台,得到了现代光学显微镜的雏形[2]。
他们利用光学显微镜做了一系列生物学观察实验,Anton van Leeuwenhoek 第一次观测到细菌以及一滴水中的微生物,1665年R.Hooke 发现细胞,这一里程碑式的发现展示了光学显微镜在生物学领域的巨大潜力。
1873年,德国人E.Abbe [3]揭示了远场光学显微镜由于光的衍射效应和有限孔径分辨率存在极限的原理,此后,提高光学显微镜分辨率工作一度停滞不前。
Abbe 分辨率极限的数值约为λ/2n ,其中λ是光波波长,n 是样品介质的折射率。
若以波长为500nm 的光成像,水折射率为1.33,分辨率极限约为200nm 。
1.2 几种非远场荧光光学超分辨技术为了提高分辨率,科学家们发明了许多新颖的超分辨技术。
由Abbe 分辨率极限λ/2n 可以知道降低光波波长是提高分辨率最直接有效的方式,采用波长2nm 的X 射线作为激发光源,实现了30nm 的分辩率[4,5]。
但低于400nm 的光通常会损伤活细胞[6],因此通常情况下X 射线显微镜无法应用于活细胞观测。
电子显微镜则利用波粒二相性,以德布罗伊波长为10-3nm 的电子束照射样品,可以达到0.1nm 的超高分辨率[7],被广泛应用于细胞生物学,但由于生物样品无法存活于高真空环境,电子显微镜同样无法应用于活细胞。
原子力显微镜使用一个传感器尖端作为探针,利用尖端的原子与物质表面原子之间的范德华力(Van Der Waals Force )来呈现样品的表面形貌,分辨率可达原子尺度[8～10]。
相似地,扫描隧道显微镜利用量子力学中的隧道效应,通过测量探针与样品表面之间的隧穿电流来判断样品表面形貌[11],对粘附于表面的结构可以获得0.1nm 横向和0.01nm 纵向分辨率。
不幸的是它们仅限于样品表面成像,并且图像获取速度缓慢,实验装置复杂昂贵,可能对生物组织造成损坏,同样无法用于活细胞。
为了避免远场衍射带来的Abbe 分辨率极限,1928年E.H.Synge 等[1213]提出近场扫描光学显微镜(Near 2field Optical Scanning Micro scopy ,NOSM ),NOSM 使用一个尺度远小于波长量级的探针(如光纤)照明样品,使照明光场限定在50～100nm 范围内,收集距离样品表面几个波长量级附近的透射倏逝波来获取样品信息,因此不受远场衍射限制,可获纳米量级的分辨率[14～16],同时可以结合全内反射(Total Internal Reflection ,TIRF )技术使用倏逝波照明样品[17]。
然而它也只能观测样品近表面区域的信息,对样品的制备有极高的要求。
1.3 远场荧光光学显微镜在生物成像中的优势与上述介绍的显微技术相比,可见光波段的远场光学显微镜具有非接触、无损伤、可探测样品内部的特点,这些特点是生物组织活细胞深层三维成像4821中 国 激 光 35卷 的先决条件。
事实上,远场光学显微镜一直是生命科学研究中最主要的工具。
荧光光学显微镜是生物学研究中最常用的一种光学显微镜,利用荧光分子作为探针标记生物组织,通过探测受激荧光分子发射的荧光信号分布获取样品的空间信息。