第六章 层析技术

Paper Chromatography
Can be used to separate the components of inks, dyes, plant compounds (chlorophyll), make-up, and many other substances
第一节 吸附层析技术
随着环境科学的发展，不仅需要对大量有机物质进 行分离和检测，而且也要求对大量无机离子进行分离 和分析。1975年，美国H.Small等人首先提出了离子色 谱这一概念。 以后层析法不断发展，相继出现亲和层析、凝胶层 析、聚焦层析等。
层析技术的基本原理
利用混合物中各组分物理、化学性质的差异， 如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配 系数等，使各组分在固定相和流动相中产生不同 的分布程度，从而使各组分以不同的速度移动而 达到分离的目的。
*气体作为流动相
*吸附在固体上的液体为固定相
按两相所处的状态分为： 液相色谱 液-固层析 液-液层析 气相色谱 气-固层析 气-液层析
（2）按层析原理分类
吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析
（3）按操作形式不同分类：
柱层析
纸层析
薄层层析
Liquid Chromatography
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质 为固定相，以液体为流动相。
通过测量并计算各化合物的迁移率（Rf），Rf值是 化合物的物理常数，可据其鉴别化合物。
• 迁移率（Rf）
在一定条件下，在相同的 时间内，某一组分在固 定相移动的距离与展层 剂自身移动的距离之比。 Rf差异越大，分离效果 越好。
• 相对迁移率
戊糖（木糖）：黄绿 已糖（果糖、葡萄糖）： 棕红、灰绿 二糖（蔗糖）：兰褐 三糖
图从左到右依次为标样： 木糖、果糖、葡萄糖，蔗 糖。以及猕猴桃提取液。
操作及注意事项：
一般薄层层析操作包括薄板制备、点样、展层、显色、 Rf值测定等步骤。
优点：
① 展层时间短，一般仅需15-60 min； ② 设备简单，操作方便，适用于分析和制备； ③ 温度变化和溶剂饱和度对Rf值影响较小； ④ 灵敏度高。
1. 吸附柱层析 2. 薄层层析 3. 聚酰胺薄膜层析 4. 疏水层析
基本原理
利用固定相的固体吸附 剂表面对不同组分吸附力 的大小差异进行分离。组 分的极性决定了吸附力的 大小。适合分离极性不同 种类（例如分离醇和芳香
烃）的化合物。
吸附剂与被吸附物质之间的吸引力是范德华力、氢键和 疏水作用等物理作用，作用可逆。
固定相与流动相？
优点：
设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重 复性好、特别是不改变样品生物学活性等。
广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生 物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的 测定、脱盐、样品浓缩等。
几个概念
排阻极限
指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子 量。代表一种凝胶能有效分离的最大分子量
总结与回顾
• 胶上蛋白质显色方法：考染、银染、荧光 标记
• 2D电泳的局限性
第六章 层析技术
引言
第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC）
引言
1850年德国科学家朗格发现了层析分离的现象 层 析 法 也 称 色 谱 法 ， 是 1906 年 俄 国 植 物 学 家 茨 维 特
羟基磷灰石层析在实验室中最大的用途是分离 双链DNA和单链DNA，亦可除去混合物中的DNA。
硅胶：
略带酸性，适用于酸性与中性样品之分离。活 性硅胶是多孔的、表面含有很多硅醇基团（-Si-OH） 颗粒状极性吸附剂。吸附作用的强弱与硅醇基的含 量多少有关，硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降 低。
活性炭：
（Michael Tswett）发现并命名的。他将碳酸钙细粉装入 玻璃管内，然后把石油醚抽提的植物叶子的色素溶液倾入， 接着用石油醚洗涤，在吸附柱上部出现了绿色的叶绿素， 中间是黄色的叶黄素，而在下面则是胡萝卜素，混合物的 不同色素组分得到了分离。 茨维特将此方法命名为色谱法（Chromatography)
操作容量： 即在特定条件下，某成分与基质反应达到平衡时，
存在于基质上的饱和容量。一般以 mmol(mg)某成 分/g(mL)基质来表示。其数值大，表明基质对某种 成分的结合力强，否则反之。
层析法的分类
（1）按两相所处的状态分类：
流动相有两种状态： 固定相也有两种状态：
*液体作为流动相
*固体吸附剂为固定相
第二节 分配层析技术
液-液层析法 原理：利用混合物在两种不相溶的液相（固定相 和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各 组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面， 流动相流过固定相。
与薄层层析的区别？
分配系数：在一定条件下，某种组分在流动相和 固定相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数， 用K表示
• 层析柱塔板理论示意图：
A 32
16
8
B
16
16
C
8
D
E
4
2
12
8
12
12
+∞
4
8
2
一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好
不同物质分配系数不同时： 不 同 组 分 的 含 量
上部 中部 下部 不同组分在柱中的位置
• 纸层析实际上是以 滤纸纤维的结合水 为固定相，以有机 溶剂为流动相。
氨基酸的纸上双向层析示意图
K=C1（固定相）/C2（流动相）
K值小表明溶质在流动相中的分配的数量多，移动快 ； K值大表明溶质在固定相分配的数量多，移动慢。
塔板理论
是色谱学的基础理论，将色谱柱看作一个分馏塔， 待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板 内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着 流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下 一个塔板，并不断形成新的平衡。
常用术语
固定相：是由层析基质组成的，其基质包括固体
物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固 定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关 的化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用。
流动相：在层析过程中推动固定相上的物质向 一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层 析时，流动相又称洗脱液或洗涤剂。在薄层层析 时流动相又称展层剂。
几个概念
吸附剂 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物
质的极性，为活性多孔固体，表面积大、颗粒均 匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。
常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基 磷灰石等。
• 羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]
表面有Ca2+和PO43-两种带电基团。酸性和中性蛋 白质可与Ca2+结合，碱性蛋白质可与PO43-结合。
1938年：理查得·库恩(Richard Kuhn)(1900－1967)， 对胡萝卜素和维生素的研究
1941年，英国的生物化学家Martin（马丁）和Synge （辛格）发展了色谱技术，把色谱法应用于AA的分离。他 们采用淀粉作为色柱里的填料，发明了分配色谱法。
用覆盖在吸附剂表面的固定液替代了仅有的固体吸附 剂，与流动相不发生混溶，提出色谱塔板理论。
吸水率
每克干胶吸收水的体积或重量
床体积（ml/g）
每克干胶溶涨后的体积
由己二酸与己二胺聚合而成
此法分析氨基酸衍生物DNP-氨基酸、PTH-氨基 酸、DNS-氨基酸时，具有灵敏度高、分辨力强、 展层迅速和操作简便等优点。
4.疏水层析
疏水层析是根据分离成分和固定相之间疏水相互 作用的差异而得到分离。 固定相一般是由基质和配体(疏水性基团)两部分 构成。
苯基(或辛基)-Sepharose CL-4B 苯基(或辛基或烷基)-硅胶(或树脂)
（备纸、点样、展层、显色与分析）
可以进行定量和定性分析
第 二 向 层 析
（ 苯 酚 ： 水 ）
第一向层析（正丁醇：甲酸：水）
第三节 凝胶过滤层析技术
排阻层析，分子筛层析：当生物大分子通过装 有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们的相对分子量 和形状大小不同而进行分离的技术。
一、基本原理
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合 物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝 胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先 被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出 入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较 慢，最后被洗脱出来。
是使用较多的一种非极性吸附剂。 活性炭主要用于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类 及某些甙，其吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶 剂中则较低弱。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于 脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子 化合物。
洗脱剂
洗脱剂是液体，也是溶解被吸附样品和平衡固 定相的溶剂。
洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度 和吸附剂的活性来选择。
气相 色谱
气体和沸点较低的化 合物，占有机物总数的 20％
氮、氦等惰性气 体，仅起运载作用， 对组分不产生相互 作用力
较高温度
不同极性的液体，
高效
高沸点、热稳定性差、 对组分可产生一定
液相 摩尔质量大的化合物，
室温
色谱 占有机物总数的80％ 亲和力，与固定相
竞争对组分的作用
目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生 物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白 质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、 染料及药物等物质的分离和分析。
在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”， 碳酸钙叫作“固定相”， 纯净的石油醚叫作“流动相”
这是利用色谱方法为探究生命现象的启蒙和开端。
1931年德国的库恩(Kuhn)等重复了茨维特的某些实验, 用氧化铝和碳酸钙分离了α、β,和γ-胡萝卜素，并用 这种方法分离了60多种这类色素。 这是利用色谱方法为探究生命现象、了解生物物体构 成的初步尝试。
突出贡献: 预测气相色谱(1952年应用);提出用细小颗粒 作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现， 诺贝尔化学奖
1952年，马丁同詹姆斯(James)一起，把分配层析应 用在分离气体上。各种气体或蒸汽的混合物可以利用氮 或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合 的气体通过后，在另一端实现分离。
Used to identify unknown plant pigments & other compounds.
Thin-Layer Chromatography
Uses thin plastic or glass trays to identify the composition of pigments, chemicals, and other unknown substances.
优点： 高分辨率 分析迅速 检测灵敏 自动记录
缺点：热不稳定、 难气化物质不适用
高效液相色谱(HPLC) 采用高压泵及填有很细的 颗粒高效色谱柱，通常采 用紫外可见光度检测，可 以对大量有机化合物进行 分析。 实现高沸点、高熔点、 易分解物质的分析。
高效液相色谱法与气相色谱法
分析对象
流ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ相
工作温度
基本原理：
在高离子强度的盐溶液淋洗下，蛋白质的疏水部分 与填料表面的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗液的 离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即 高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。
一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成 的疏水键越强。
特征：
• 避免了使用大量有机溶剂的淋洗 • 采用高盐时上样、低盐时洗脱 • 洗脱条件温和---降低盐浓度 • 调整溶液的pH可调整该蛋白的疏水性。
洗脱体积（Ve）：
是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。
1. 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为 固定相，以有机溶剂或缓冲液为 流动相构成柱状的一种层析方法。
常用的吸附剂有羟基磷灰石、 硅胶、氧化铝、人造沸石和活性 炭等。
2.薄层层析(Thin layer chromatography)
3.聚酰胺薄膜层析
聚酰胺薄层为固定相。聚酰胺能和被分离物之间 形成氢键，对极性物质有很强的吸附作用。这种氢 键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附 能力的大小。
在层析过程中，展层溶剂 与被分离物质在聚酰胺表面 竞争形成氢键，使被分离的 各种物质在溶剂与聚酰胺表 面之间的分配系数有较大差 异，经过吸附与解吸附的展 层过程，形成一个分离顺序， 彼此分开。