第十章 层析
层析的概念和分类
层析的概念和分类
层析（chromatography）是一种利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，用于分离混合物中的各个组分。
层析系统由两个相组成：固定相和流动相。
当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同。
随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。
根据不同的分类标准，层析可以分为多种类型：
1. 根据固定相的形式，层析可以分为柱层析和平板层析。
柱层析是待分离物质在柱状固定相中进行的层析分离技术，而平板层析则是在平板型固定相中进行的分离技术。
2. 根据流动相的组成，层析可以分为有机层析和无机层析。
有机层析是利用有机溶剂作为流动相的层析技术，而无机层析则是利用无机溶剂或无机盐溶液作为流动相的层析技术。
3. 根据分离原理，层析可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅化学书籍或咨询化学专家。
层析名词解释
层析名词解释层析（Diffusion），是指物质从高浓度区域向低浓度区域自发流动的过程。
它是一种重要的物质传输方式，广泛应用于生物学、化学、物理学等领域的研究中。
层析过程的实现需要以下几个关键要素：1. 被分离物质的混合物：通常由多种不同组成的物质混合而成，需要进行分离。
2. 层析柱：提供分离材料的载体，通常是一个空心管子，内壁涂有吸附材料。
3. 层析介质：填充在层析柱内部的材料，其特性决定了被分离物质的分离效果。
4. 流动相：通过层析柱的流体，能够使被分离物质在层析介质中传输。
层析根据不同的分离机制可以分为几种类型：1. 吸附层析：基于物质在固体表面的吸附性质进行分离。
层析介质通常是一种多孔结构的固体，吸附分离的程度取决于物质和固体之间的亲和性差异。
吸附层析广泛用于制药、化学工程等领域的分离纯化过程中。
2. 离子层析：利用物质之间的电荷差异进行分离。
层析介质通常是带电基团的树脂，吸附和解吸过程通过改变流动相的盐浓度来调节。
离子层析常用于核酸、蛋白质等生物大分子的纯化。
3. 凝胶层析：利用分子在凝胶基质中的渗透性差异进行分离。
凝胶通常是一种交联的高分子物质，通过控制凝胶孔径大小和交联程度来实现不同分子的分离。
凝胶层析广泛应用于蛋白质、核酸等大分子的富集和纯化过程中。
层析的分离效果受多种因素影响，如流动相的流速、吸附介质的性质、温度等。
为了提高层析的分离效率，常常采用多级层析（多个层析柱串联）或亲和层析（利用结合剂和配体之间的特异性相互作用进行分离）。
此外，还可以通过改变流动相的性质（如pH值、离子浓度等），加大以某一组分为目标的分离效果。
总的来说，层析是一种重要的分离技术，具有良好的选择性和灵活性，在生物学、化学等领域中被广泛应用于分离和纯化过程中，对于研究和生产具有重要意义。
层析
层析简介层析（chromatography）利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。
色谱为层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
chrome意为色彩，graphy源自希腊文，意为写，加在一起，意为色谱。
层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力。
类别按层析的机理划分有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
按流动相与固定相的不同划分有气相层析、液相层析。
这两大类层析是以流动相不同来划分的。
如同时区分流动相和固定相，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。
按操作形式划分有柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。
以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。
基本原理层析须在两相系统间进行。
一相是固定相，需支持物，是固体或液体。
另一相为流动相，是液体或气体。
当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。
随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层系数K是物质在两相中的浓度比。
K值大，则在固定相中吸附牢，K值小吸附差。
各物质间的K值差别大，则易被分离。
不同类型层析的K值含义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。
研究层析现象而发展的塔板理论，与有机化学实验中的分馏法原理有些相似。
被分馏的有机溶剂在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层，从而把低沸点溶剂先分馏出来，达到纯化的目的。
在层析时用理论塔板数n来衡量层析效能。
tR为物质在层析柱上的保留时间，W为洗脱下来的物质峰形的宽度。
n值愈大表示层析柱的效能愈高。
如用理论塔板高度H表示，则包含了层析柱长度的因子。
式中L为层析柱的柱长。
H值越大，则柱效越低。
层析的原理和应用
层析的原理和应用1. 层析的概念和基本原理层析（Chromatography）是一种将混合物中的组分分离和提纯的技术方法。
它基于组分之间在固定相和流动相之间的相互作用力的不同，使各种组分在系统中以不同速度迁移，达到分离的目的。
层析技术广泛应用于化学、生物、环境等领域。
层析技术的基本原理是利用流动相在固定相上的移动来实现物质的分离。
固定相通常是具有一定吸附性或分配性的材料，如硅胶、纸张、亲水性基质等。
流动相则是将待分离的混合物溶解在溶剂中，通过与固定相的相互作用，使各组分在固定相上以不同速率迁移。
2. 层析技术的分类和应用层析技术根据其基本原理和操作方式的不同，可以分为多种类型。
以下是其中几种常见的层析技术及其应用：2.1 薄层层析法（TLC）薄层层析法是一种在薄层材料上进行的层析技术。
常用的薄层材料包括硅胶和氧化铝等。
它具有简单、快速、经济的特点，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
2.2 柱层析法柱层析法是将固定相填充在柱中，通过流动相沿着柱内固定相的分布，实现各组分的分离。
根据固定相的不同，柱层析法又可分为凝胶柱层析和高效液相层析等。
柱层析法在药物分离纯化、天然产物提取、有机合成等领域具有广泛应用。
2.3 气相层析法（GC）气相层析法是将待分离的混合物蒸发为气体状态，通过在柱中固定相的分离，最终使各组分在检测器上进行定性和定量分析。
气相层析法广泛应用于石油化学、环境监测、食品安全等领域。
2.4 液相层析法（LC）液相层析法是将待分离混合物溶解于液相，在柱中利用固定相进行分离。
液相层析法根据流动相的不同，可分为常压液相层析和高效液相层析等。
液相层析法在制药、生物、环保等领域具有广泛应用。
2.5 离子层析法（IC）离子层析法是利用不同组分之间的化学亲合性进行分离的一种层析技术。
它广泛应用于水质分析、环境监测、生物学研究等领域，尤其是对离子的分析具有很高的选择性和灵敏度。
3. 层析技术的优点和局限性层析技术具有许多优点，使其成为众多分析方法中的重要手段。
层析理论及技术
29
Biochemistry experiment 8
2012-7-7
凝胶柱的选择
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Biochemistry experiment 8
2012-7-7
凝胶的前处理
a. 溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水 浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去 上层悬浮物及蒸馏水。 b. 碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。 c. 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。 d. 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液 pH与起始缓冲液相同。
根据层析分离机制
根据操作形式不同
4
按层析过程的机理分类：
5
Biochemistry experiment 8
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离子交换层析法原理
利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同。 特点：利用带有相反电荷的颗粒之间具有 引力作用 固定相：带有大量电荷的离子交换剂 流动相：具有一定pH值和一定离子强度的 电解质溶液 常采用柱层析 洗脱方法：增加离子强度、改变pH值。
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上柱、洗脱、收集
a. 如图装好层析装置，打开下端出 口，使溶液流出至刚好达到凝胶 胶面 b. 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下 端出口，使样品溶液流出至刚好 达到凝胶胶面，再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁。 c. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 d. 用自动部分收集器自动或手动收 集，合并同一高峰各管。
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装柱
a. 将层析柱垂直固定，加入适 量溶剂排走空气。 b. 将平衡好的凝胶搅匀，连续 倾入柱中，待其自然沉降至 1/4~1/3高时打开下端出口， 让溶剂慢慢流出，继续侵入 凝胶至沉降到所需高度。装 柱时要注意操作压。 c. 用3-5倍柱床体积的起始缓冲 液走柱，使交换剂充分平衡， 柱床稳定。
层 析PPT演示课件
主要机理是分子筛效应,当被分离物质 流经凝胶柱时,因各组份的分子大小不同,在 凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组 分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
3
色谱历史 古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）
1903（1906）年，Michael Tswett提出色谱法 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现 代色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)
层析
CHROMATOGRAPHY
1
掌握：层析的概念、一般原理 凝胶层析的基本原理 装层析柱的过程及装柱要求
熟悉：层析技术的分类 凝胶层析的特点 凝胶的结构与性质
了解：凝胶的选择 柱、样品、洗脱液的选择 凝胶的保存
2
一.概述
层析Chromatography(色谱),利用混合 物中各组分的物理化学性质间的差异(溶解 度、分子极性、分子大小、分子形状、吸 附能力、分子亲合力等) ，使各组分在支持 物上集中分布在不同区域，借此将各组分 分离。
10
.离子交换层析 （ion-exchange chromatography ） ----利用离子交换剂与各组分之间的离子亲和
力不同而进行层析分离的方法。
.凝胶层析（gel chromatography） ----利用不同组分之间分子大小不同，在通过
凝胶介质时所受到的阻滞作用的差异而进 行分离的方法。
其固定相也可有两种状态，一种是以 固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂 布在固体载体表面的液体作为固定相。
层析技术
质也可以是固定在固
离的物质朝着一定方
体物质上的液体物质。 向移动的液体或气体。
这些物质能与待分离
柱层析中的流动相一
的化合物进行可逆的
般称为洗脱剂。它也
吸附、溶解与交换作
是层析中的重要影响
用，对分离混合物起
因素之一。
着关键作用。
流动相在推动固定相中的混合物朝一个方 向移动是，由于混合物中各组分的理化性 质（吸附力、溶解度、分子形状和大小、 分子极性、分子亲和力等）的差异，各组 分受固定相的阻滞作用和受流动相的推动 作用各不相同，在层析柱中移动速度也不 同，从而使混合物中结构上只有微小差异 的组分分离开来。
2、析法的特点
(1)分辨力高 (2)分析效率高 (3)灵敏度高 (4)应用广泛 局限性：在定量分析中需要纯制得标准物
质；不能精确地解决物质的化学结构问题
二.层析技术的分类
1. 按流动相的形式不同
气
气-固
相 以气体作为流动相
层
气-液
析
液 液-固
相
以液体作为流动相
层 液-液
析
2.按层析的原理可分为
样品
流 动 相
大分子
较快流出
2.凝胶层析的介质
凝胶是一种多孔网状结构物质。层析用的 凝胶一般都呈球形，颗粒的大小通常以目 数来表示。层析的分辨率和流速与凝胶颗 粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效 果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。 一般常用的是100~200目。
目前常用的有交联葡聚糖凝胶，交联琼脂 糖凝胶，丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺葡聚 糖凝胶以及Superdex
在实际工作中，可根据被分离的物质的性质，选 用适当类型的离子交换剂。分离碱性蛋白质常用 阳离子交换剂，分离酸性蛋白质常用阴离子交换 剂。分离蛋白质样品时一般常用弱型交换剂。
层析
薄层层析
匀涂铺在薄板上，点样 后用流动相展开，使各 组份分离。
凝胶层析技术
概念：凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析，当生物大分子随流 动相通过装有作为固定相的凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子 大小不同而进行分离的技术。
原理：凝胶颗粒内部具有多孔性网状结构，被分离的混合物流过
层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒
凝胶过滤分离血红蛋白和鱼精蛋白
2015.3
背景知识
层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。 他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动 后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论。 1944年出现纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层析、亲和层析、 凝胶层析、气相层析、高压液相层析等。
定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析 技术称为吸附层析。常用吸附剂：活性碳、硅。 离子交换层析: 是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子 大小差异而将物质予以分离的一种方法。 凝胶层析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物 质，不带电荷，可起滤过或“筛”的作用。 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。
又完全进入床内）当少量洗脱液將流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿 搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。
5. 分布部收集
用自动部分收集器，以5滴 分钟，5分钟 管的速度进行收集。并且
观察柱上的色带，待黄色的 K3Fe(CN)6 色带完全洗脱下来后，再继续收集两管 透明的洗脱液作为空白，关闭出口。
凝胶层析分离技术
控制凝胶收缩
影响洗脱的因素
流速对蛋白质分辨率的影响 操作压与流速的关系
流速对蛋白质分辨率的影响
黏
黏度对分辨率的影响
度
对
分
辨
率
的
影
响
凝胶柱层析操作压
操作压与流速的关系
加样量对分辨率的影响
I .加养量少时，
A、B二种物质充全 分开。
II.加养量适当
时，A、B 二种物 质刚刚分开。
按操作技术4的方法，将1mL标准蛋白质混合液上柱， 然后用0.025mol／L氯化钾-0.2mol／L乙酸溶液洗脱。 流速3mL／10min，3mL／管。用核酸蛋白质检测仪 280nm处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线， 或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管光吸 收值。
以管号(或洗脱体积)为横坐标，光吸收值为纵坐标作出 洗脱曲线。
Kd (Ve Vo) Vi
0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化
四、有效分配系数（Keff）
Kd (Ve Vo) Vi
将Vt-Vo代替Vi，则：
K e ff
（（VVet
V0） V0）
即：Ve＝Vo十Keff(Vt-Vo)
实际上， Keff是将以水作为固定相(Vi)改为水与凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固 定相，而洗脱剂(Ve-Vo)为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，
一、凝胶的结构与分子筛效应
动画演示
二、凝胶床总体积
Vt ：柱床 “总容积”， Vo：即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的 水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所 含水相的容积。 Vg：凝胶本身的容积；
Vt＝Vo十Vi十Vg 或 Vt-Vo = Vi十Vg，
层析的概念
层析的概念层析的概念层析是一种物理化学分离技术，利用样品中不同成分在固定相（也称为层析柱）和流动相（也称为移液相）之间的差异性，通过逐渐分离出各个组分达到纯化或者分离的目的。
层析技术广泛应用于生物、化学、制药等领域中。
一、层析技术的基本原理1.1 固定相固定相是指在某种材料上涂覆或者填充有一种特殊化合物，这种化合物能够与样品中成分发生作用，并且能够将不同成分区分开来。
常见的固定相包括硅胶、氧化铝、聚合物等。
1.2 流动相流动相是指在固定相中流动的液体，它可以将样品输送到固定相上，并且通过与固定相发生作用来实现成分之间的分离。
流动相可以是单一溶剂或者是多种溶剂混合而成的溶剂体系。
1.3 分离原理在层析过程中，样品中不同成分会因为它们与固定相和流动相之间作用力的不同而被逐渐分离。
比如，如果一个成分在固定相上的亲和力比较强，那么它就会在固定相上停留的时间比较长，从而与其他成分分离开来。
二、层析技术的分类2.1 按照固定相的不同，层析技术可以分为几种类型：- 气相层析（GC）- 液相层析（LC）- 离子交换层析（IEC）- 亲和层析（AC）- 尺寸排除层析（SEC）2.2 按照流动相的不同，层析技术可以分为几种类型：- 反相层析- 正相层析- 离子对反向色谱- 亲和色谱三、常用的层析技术3.1 气相层析气相色谱是一种利用气体作为流动相，在某种特殊材料上涂覆有化合物作为固定相，在高温下将样品中各个组分逐渐分离出来的技术。
气象色谱广泛应用于环境、食品、制药等领域。
3.2 液相色谱液象色谱是一种利用液体作为流动相，在某种特殊材料上涂覆有化合物作为固定相，通过逐渐分离出各个组分达到纯化或者分离的目的。
液相色谱广泛应用于生物、制药、食品等领域。
3.3 离子交换层析离子交换层析是一种利用带电荷的固定相与样品中带电荷的成分之间发生作用，通过逐渐分离出各个组分达到纯化或者分离的目的。
离子交换层析广泛应用于制药、生物等领域。
层析技术讲义
层析技术讲义层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。
他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。
当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。
随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。
为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。
他们首先提出了色谱塔板理论。
这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。
其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。
特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。
前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。
因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。
如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。
但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。
现在我们简称为层析法或层析技术。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。
而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。
因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。
第十章 层析分离法 应国清老师课件
Am + Kd ·As（固定相的平均截面积）
t0（死时间） = ————
线速度（ν）
tR = t0（1 + k’ 1 k’）
4. 分离度 R = ————
W 1+ W 2 tR2 —tR1
5、塔板理论——塔板数、塔板高度
• 塔板数
N = 5.54 { ————} W h/2
tR
2
• 塔板高度 L
H = ——— N
4、亲和层析剂的制备
1) 载体（骨架）的选择 –
载体（骨架） 配基
活化剂
载体的要求
• • • • 载体骨架高度亲水、惰性 具有大量可供活化的化学基团 具有较大孔径的网状结构 良好的化学、物理、生物稳定性
–
常用的载体
• • • 多糖类（葡聚糖、琼脂糖、纤维素等） 有机聚合物（聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等） 混合类（改性硅胶、多糖+树脂等）
八. 有机染料亲和层析
1. 定义——利用某些类似于NAD+结构的有机染料
（蒽醌及偶氮化合物）作为配基制成亲和层析剂进 行差别分离过程。
2. 特点——结合容量大；配基价廉、易得；层析
剂制备简便；化学稳定性好。
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓色层分离法？可分为那几大类？ 简述柱层析系统的工艺流程。 何谓保留值、分配容量K、分离度？ 何谓亲和色层分离法？亲和力的本质是什么？亲和色 层中常用的亲和关系有那几种？ 5. 6. 何谓疏水作用层析？其最大的特点是什么？ 柱层析法与固定床吸附法有何异同点？
2）配基的选择
• • 专一性配基——参照生物亲和关系 类别性配基——酶的辅酶（NAD+、NANP+、ATP等）、外
层析名词解释生物化学
层析名词解释生物化学
嘿，咱今儿个就来好好唠唠层析这个在生物化学里超重要的玩意儿！
你知道不，层析就好比是一场神奇的分离大冒险！比如说，咱把一
堆乱七八糟的混合物放进去，就像把各种颜色的糖果混在一起。
然后呢，通过层析这个魔法过程，就能把它们一个一个地分离开来，清楚
得很呢！就像你能清楚地挑出红色糖果、蓝色糖果一样。
想象一下，这就像是一场赛跑，不同的物质在层析的跑道上奔跑，
速度不一样，跑的路径也不一样，最后就各自到达了不同的终点，被
我们清楚地分辨出来啦。
这多有意思呀！
在生物化学的世界里，层析可是大功臣呢！科学家们用它来分离蛋
白质呀、核酸呀这些重要的生物分子。
比如说，要研究某个蛋白质的
结构和功能，就得先把它从复杂的混合物里分离出来呀，这时候层析
就派上大用场啦！“哎呀，没有层析可咋办呀！”
咱再举个例子哈，要是没有层析，就好像你在一堆杂物里找一个小
小的戒指，那可太难啦！但有了层析，就像是有了一双神奇的手，帮
你把戒指一下子就挑出来啦。
总之呢，层析在生物化学里那绝对是不可或缺的存在呀！它让我们
能更深入地了解生物分子的奥秘，为生物科学的发展立下了汗马功劳呢！我觉得呀，层析真的是太神奇、太重要啦！以后肯定还会有更多
更厉害的应用呢！。
层析原理与技术课件
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Equilibration
Sample Application
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Sample Adsorption
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Elution
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高 疏水作用
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的应用
• 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的
蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的 蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 • 2.脱盐
第16页/共54页
1 34 2.00 1.75
1.50 pH 6.0
生物化学实验层析技术和原理
生物化学实验层析技术和原理层析技术的原理是，流动相沿固定相或凝胶材料均匀流动，并与样品中的成分发生相互作用。
在这个过程中，不同成分的分布系数不同，一部分样品成分将分配到固定相上，而其他成分将留在流动相中。
随着流动剂的稳定流动，样品成分会相对稳定地分布在固定相和流动相之间，从而实现分离。
层析实验中最常用的固定相是硅胶或氨基硅胶。
这两种固定相具有相亲性和分离成分的能力。
流动相（也称为溶剂）的选择取决于样品性质和需要分离的成分。
流动相可以是有机溶剂或水溶液，通常会根据不同的系统进行优化。
层析技术主要有几种类型：薄层层析、柱层析、凝胶层析和高效液相层析（HPLC）。
薄层层析是最简单和最常见的层析方法之一、它使用涂覆在玻璃或塑料板上的薄层介质，如硅胶或氯化铝，将样品分离成各个成分。
样品在薄层介质上展开，然后通过浸泡或喷涂内外的化学试剂来显色，以使成分显示为不同的带状。
可以使用紫外线或其他光源进行检测和定量。
柱层析也是常用的分离技术之一、它通常使用石英柱或玻璃柱作为固定相，流动相通过柱子进行分离。
样品在柱子上负荷后，使用适当流动相进行洗脱。
根据样品的性质和需要，可以选择不同类型的柱子和流动相。
例如，在反相层析中，疏水性柱子配合有机溶剂流动相可分离疏水性成分。
凝胶层析使用凝胶作为固定相，通常使用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。
在凝胶层析中，样品分子通过固定凝胶孔隙之间的透明度差异进行分离。
根据样品的大小和需要进行选择凝胶孔隙的大小，以实现目标成分的分离。
HPLC是一种高效、自动化和精确的层析技术。
它使用高压泵将流动相推入柱子中，并使用检测器实时监测和记录分离的成分。
HPLC通常选择高分辨率的固定相，如硅胶、氨基硅胶或C18柱。
HPLC可以根据需要使用各种流动相和检测器，例如紫外光检测器或质谱检测器。
层析技术在生物化学领域中具有广泛的应用。
它可以用于从生物样品中纯化蛋白质、核酸、酶和药物等目标物质。
层析技术的选择取决于样品的特性、目标物的大小和属性，还有需要分离和纯化的成分的数量。
项目4-10层析技术讲义教材
凝胶颗粒
凝胶过滤在试验室中的应用
1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）分级分离 4）溶液浓缩 5）平衡常数的测定 6）细胞及颗粒的分离
▪蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关，
LogM=k1-k2（VeVe为洗脱体积）
LogM
LogM 测
A B
C
V测
先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲
线即可确定分子量。
4、离子交换层析法
原理
根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的 亲和力不同而达到分离的目的。 • 将离子交换树脂装入层析柱。 • 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分 子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基团的称 为阳离子交换树脂，可解离出 H+，含有碱性可解离基团的称 为阴离子交换树脂，可解离出 OH-
• 于是就在两相之间一次又一次地发生分配过程（相当 于一次又一次的萃取），从而将各组分逐个分开。
薄层层析
• 利用吸附剂对化合物吸附能力的不同而达到分离，吸 附剂吸附能力的大小与化合物极性大小有关。由于硅 胶或氧化铝薄层的毛细管作用，展开剂将沿着薄层逐 渐上升。在上升过程中，当遇到新的吸附剂时，又被 吸附下来。接着又被不断流过的展开剂溶解，再随着 展开剂继续上升。
吸附原理
• 待测物被柱子中免疫吸附剂上的抗体所吸附，通过淋 洗除去柱上吸附的杂质，最后待测样品被一种易蒸发 的溶剂洗脱下来。用IAC技术，样品通常只经过一次萃 取就可直接用于薄层色谱法、荧光光度法、HPLC或GCMS测定，也可用免疫学方法检测。
工作原理
7、高压液相层析（HPLC）
▪ 特点
①使用的固相支持剂颗粒很细，表面积很大,因而 分辨率很高。 ②溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大。 许多类型的柱层析都可用HPLC来代替，如分配层析、 离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。
层析原理
薄膜层析法
将适当的高分子有机吸附剂制 成薄膜，以类似纸层析方法进 行物质的分离
亲和层析法
• 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配 体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的 的一类特殊层析技术。
• 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离 效率高。对分离含量极少又不稳定的活 性物质尤为有效。但本法必须针对某一 分离对象，制备专一的配基和寻求层析 的稳定条件，因此亲和层析的应用范围 受到了一定的限制。
⒈离子交换剂预处理和装柱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量 碎 的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均 匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步 骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处 理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离 子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转 为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂 则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交 换剂。
亲和层析可用于纯化生物大 分子：稀溶液的浓缩；不稳 定蛋白质的贮藏；从纯化的 分子中除去残余的污染物； 用免疫吸附剂吸附纯化对此 尚无互补配体的生物大分子； 分离核酸是亲和层析应用的 一个重要方面。
离子交换层析法
离子交换层析法是以具有离子 交换性能的物质作固定相，利用 它与流动相中的离子能进行可逆 的交换性质来分离离子型化合物 的一种方法。
层析技术
层析技术的原理
层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固 体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动 相，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定 相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生 相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两 相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力 越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向 前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组 份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样 品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目 的。
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10.4 层析操作方法
一、柱层析 ◆基本装置
◆基本操作 ★柱准备(要求：均匀、不分层、无气泡) 选柱：直径与长度比一般柱1∶10 ~ 50， 凝胶可选1∶100 ~ 200； 介质处理：溶胀、清洗、排气泡(抽气)； 装柱：干法或湿法，自然沉降，不露介质 ★平衡：用3~5倍柱床体积平衡液，在洗脱 时的恒压下流经装好的柱介质；
第三部分 均相体系分离技术
第十章
层析分离技术
10.1 概述
图10.1 层析发明示意图
◆ 层析法也称色谱法， 1906 年 俄 国 植 物 学 家 Michael Tswett 将植物叶子的色素 通过装填有吸附剂的柱子， 各种色素以不同的速率流 动后形成不同的色带而被 分开，故命名为“色谱法” （ Chromatography) 。 后 来无色物质也可利用吸附 柱层析分离。
10.2 相关基本概念
◈ 层析 利用混合物中各组分在两相中的分布差 异，以其为流动相流经固定相使在两相间转 移而实现分离的方法称层析分离技术。 ◈ 固定相 层析的基质。它可以是固体物质（如吸 附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液 体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）， 这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸 附，溶解，交换等作用。
◆基本原理：相当于一种连续性的溶剂提 取方法。固定相液体需一种固体支撑载 体，此固体不起分离作用。用作冲洗的 液体流动相与固定相发生接触，样品中 各成分即在两相间的分布不同，因易溶 于流动相的成分移动快，而在固定相中 溶解度大的成分移动慢，依此得到分离。 这种分离不经过吸附程序，仅由溶剂提 取而完成，
◈死时间间称为死时 间(dead time，tM ) 。
◈死体积: 不被固定相滞留的组分，从进样 至出现浓度最大值时流动相通过的体积称 为死体积(dead volume，VM ) 。
◈ 操作容量 : 指在一定条件下，某种组分与固 定相反应达到平衡时，存在于固定相上的饱 和容量。数值越大，固定相对该物质的亲和 力越强。
◆定义：以具有网状结构的凝胶颗粒作为固 定相，根据筛分原理，利用物质的分子大小 进差异行分离的技术。也叫分子筛层析、分 子排阻层析。
◆优点：操作简便，设备简单，分离效果 好，重复性高，分离条件缓和，应用广 泛。 ◆缺点：分辨率不高，分离操作慢。
◆基本原理：凝胶颗粒内部为多孔网状结构， 被分离的混合物流过时，比凝胶孔径大的分 子不能进入孔内，从凝胶颗粒之间的空隙向 下移动，最先流出；比网孔小的分子能不同 程度的自由出入凝胶孔内，在柱内经过的路 程较长移动速度较慢，最后流出来。 ◆层析凝胶必备条件： ★惰性、亲水强，有一定的孔径分布范围； ★稳定性强，能在较宽的pH和离子强度范围 及化学试剂中使用； ★机械强度高，允许较高的操作压力；
层析法的特点
（1）分离效率高。 （2）应用范围广。 （3）分析速度快。 （4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一次完成。可以和多种波谱 分析仪器联用 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。
◆ 层析基本原理
不同的物质的物理、化学与生物学性 质（如溶解度、吸附力、分子形状及大小、 分子亲和力、分配系数、立体化学性质、 荷电特性、分子亲和力及特异的生物学反 应等）不同，在同一溶剂中的分布程度存 在差异，同一物质在不同溶剂中的分布也 不同，当在互不相溶的两相中经过一定时 间迁移即可被分离。
◆常用亲水性离子交换剂： CM- 纤维素， DEAE- 纤 维 素 ， CM- 交 联 葡 聚 糖 ， DEAE-交联葡聚糖CM-Sepharose CL-6B 磷酸纤维素，
五、亲和层析法
◆基本原理：将具有亲和力的两个分子中 的一个固定在以共价键形式与不溶性载体 相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份 的样品通过此固定相时，只有和固定相分 子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸 附结合，其它没有亲和力的无关组份就随 流动相流出，然后改变流动组成份，将结 合的亲和物洗脱下来。
◈保留值：试样中各组分在色谱柱中停留的 时间值或将组分带出色谱柱所需流动相的 体积值。
◈保留时间(retention time，tR)：
从进样开始到某个组分在柱后出现浓度 最大值的时间。 ◈保留体积(retention volume，VR)：
从进样开始到某组分在柱后出现浓度最 大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。
◆ 常用吸附剂
表10. 1 生物分离中常用吸附剂
◆洗脱剂必具条件： ① 纯度较高； ② 稳定性好； ③ 能较完全洗脱下所分离的成分； ④ 黏度小； ⑤ 易和所需要的成分分开。 二、分配层析( partition chromatography ) ◆定义：利用被分离组分在两种不相混溶的 液体(固定相与流动相)中的溶解度差别所造 成的分配系数差别而使混合物被分离。
图10.2 植物色素分离示意图
色谱法的发展历程 ◆1903 年 Tswett 创立色谱法（在碳酸钙上分 离了叶绿素）。但分离效率低，分离时间 长，根据样品的不同，一般分离需要几小 时至几天。 ◆20 世纪 40 年代至 50 年代初，先后出现了纸 色谱（ paper chromatography,PC ）和薄膜 色谱法 (thin-layer chromatography,TLC) 。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短， 样品量要求小。
◆定义 : 是利用吸附剂对液体或气体中某组 分具有选择性吸附的能力， 用固体吸附剂 作层析的固定相， 使欲分离组分富集在吸 附剂表面，再用适当的洗脱剂将其解吸而 实现分离纯化的过程。 如气－固吸附层析 和液－固吸附层析。
◆基本原理：生物大分子以范德华引力、静电 引力可逆结合于吸附剂表面吸附位点 , 在洗 脱剂（流动相）的作用下被解吸下来的物质 向前移动时，遇到前面新的吸附剂会被重新 吸附，又被后来的洗脱液再次解吸，继续向 前移动。经这样反复地吸附 - 解吸 - 再吸附 再解吸的过程。物质沿洗脱液的前进方向移 动过程中，吸附能力强的向前移动速度慢， 吸附弱的移动快，不同组分便会逐渐分离开。
◈ 流动相 在层析过程中，推动固定相上待分离 的物质朝着一个方向移动的液体、气体或 超临界体等，都称为流动相。柱层析中一 般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 ◈ 分配系数 在一定的条件下，某种组分在固定相 和流动相中含量（浓度）的比值，常用 K 来表示。
◈ 迁移率： 在一定条件下，相同的时间内某一组 分在固定相移动的距离与流动相本身移动 的距离之比值。常用Rf来表示。 ◈相对迁移率： 在一定条件下，相同时间内，某一组 分在固定相中移动的距离与标准物质在固 定相中移动的距离之比值。
◆1952 年， James 和 Martin 提出了以气体为流 动相的气相色谱法（gas chromatography,GC) 其应用范围广泛受到人们重视。但对不易气化 和热不稳定性差的化合物难以分离。 ◆20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料、 高压输液泵和高灵敏度监测器的出现，发展 出 了 高 效 液 相 色 谱 （ High performance liquid chromatograghy, HPLC）。
图10.4 分子筛层析原理示意图
◆常用层析凝胶 ★葡聚糖凝胶(dextran gel，Sephadex)； ★聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，BioGel P) ★琼脂糖凝胶(agarose gel，Sepharose)； ★琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(Superdex) ◆凝胶过滤层析的应用 ★生物大分子物质的分离纯化 ★分子量与平衡常数的测定 ★分级分离、溶液浓缩 ★细胞及颗粒的分离
四、离子交换层析法 ◆定义：以离子交换剂为固定相，根据物 质的带电性质不同利用离子交换剂与被分 离物间的亲和力差异，以电解质溶液为流 动相，通过置换实现对目标物质分离的层 析方法。
◆离子交换层析法的特点：具有灵敏度高， 重复性、选择性好，分析速度快等优点， 是当前最常用的层析法之一。
◆离子交换基本原理
★上 (加)样：加样量＜20%操作容量，体 积＜5%柱床； ★洗脱：洗脱液恒压下过柱，有恒定洗脱、 分步洗脱和梯度洗脱3种方式； ★检测和收集：通常采用光度法(如可见或 紫外)检测。部分收集器收集。
图10.5
◆离子交换剂应具备的条件 ★有高度的不溶性；而在各种溶剂中进行交 换时，交换剂不发生溶解 ★有疏松多孔的结构或巨大的表面积，能使 交换离子在交换剂中进行自由扩散和交换 ★有较多的交换基团
★有稳定的物理化学性质，在使用过程中， 交换剂不能因物理或化学因素的变化而发 生分解和变形等现象
◆离子交换剂类型 强酸型 阳离子型 弱酸型 离子交换树脂 强碱型 (疏水型) 阴离子型 弱碱型
◆吸附剂的选择：
①较高的选择性以达到一定的分离要求； ②较大的吸附容量以减小用量； ③较好的动力学及传质性以实现快速吸附； ④较高的化学及热稳定性，不溶或极难溶于 待处理流体以保证吸附剂的数量和性质；
⑤较高的机械强度以减小磨损和侵蚀；
⑥较好的流动性以便于装卸；
⑦较高的抗污染能力以延长使用寿命；
⑧惰性良好以避免发生不期望的化学反应； ⑨易再生；价格便宜。
◆ 根据层析机理：
◈ 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸 附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 ◈ 分配层析：利用不同组分在流动相和固定 相之间 的分配系数不同实现分离。 ◈ 离子交换层析：利用不同组分对离子交换 剂亲和力的不同分离。 ◈ 分子筛层析：利用某些凝胶对于不同分子 大小的组分阻滞作用的差异分离。 ◈ 亲和层析法：利用固定相只能与待分离组 份的专一亲和力与其它组份分离。
◈ 分辨率： (分离度 ) 指相邻 两个层析峰 的分开程度。 用Rs表示， Rs越大，两 组分分离效 果越好。
图10.3 层析峰与分辨率示意图
◈洗脱剂与洗脱液：用作流动相有液体称洗 脱剂。流经固定相后的流动相即洗脱液。 ◈洗脱体积：使溶质从柱中流出时所通过的 流动相的体积。不同的溶质有不同的洗脱 体积。
◈ 正相色谱 : 指固定相的极性高于流动相的极 性。非极性分子或极性小的分子比极性大的 分子移动速度快，先从柱中流出来。