农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

一、目的要求

通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理

农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法

1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法

操作︰

（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。取自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。 取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；

（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。 （5）共培养︰将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十

IAA0.5mg/L + BA2.0mg/L) ，在28℃暗培养条件下共培养2～4 天（光对某些植物的转化有抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异）。

（6）选择培养︰将经过共培养的外植体转移到加有选择压（以NPT－Ⅱ为标记基因时一般使用卡那霉素，烟草以100mg/L 的选择浓度为宜，其它植物需通过敏感实验确定）的脱菌（附加250～500mg/L 的羧芐青霉素或头孢霉素，抑制农杆菌生长）分化或愈伤组织诱导培养基上，在光照为2000～10000lx、25℃条件下进行选择培养。

（7）继代选择培养︰选择培养2～3 周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中令其生长或诱导分化。

（8）生根培养︰待不定芽长到1cm 以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生根培养，两周左右长出不定根。

（二）细菌的植物组织培养基悬浮液浸染法

此方法与上述的细菌培养液直接侵染法不同之处是用于侵染的农杆菌被悬浮在植物组织培养液（如1 / 2MS 、MS 或其它培养液中），而不是细菌培养液（如YEB 或LB 等）中。具体做法有两种︰

（1）在超净工作台上，将按上述方法培养的OD600 为0.6～0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，4000r/min 离心5 分钟，去掉上清液．菌体用MS 液体培养基（pH5.4～5.8）重悬，稀释至OD600为0.2 左右，用于转化。

（2）另一方法是取适量的OD600 为0.6～0.8 的菌液加入到30～50 倍体积无激素的组织培养液体培养基中（pH5.8)，（同时可加入100μmol/L 的AS ) ，在上述条件下继续振荡培养2 ～ 4 小时，至OD600为0.2 左右时用于侵染。

说明︰

（1）上述的各种做法．包括加入AS 及不加AS ，都能获得一定的转化率。侵染时采用哪种做法，除要根据受位材料及菌株情况选定外，也有个人的习惯。

（2）如果共培养后，外植体周围菌体很多，转入选择培养时，可先用液体MS 培养基冲洗材料．吸干液体后再转入选择培养基。但这种作法常常引起材料损伤，应尽量避免。

（3）为提高转化细胞成活率，可采用哺育细胞看护培养及延迟筛选的方法。哺育细胞看护培羌是以迅速生长的植物细胞悬浮系（常用胡萝卜悬浮细胞系）为哺育细胞。共培养对在共培养的培养基表面铺上一层哺育细胞层，然后覆诱@张无菌滤纸，将侵染后的材料成在滤纸上面进行共培养，哺育细胞的滋养有利于转化细胞成活。所谓延迟筛选是指共培养后的材料不马上转入筛选培养基中，而是先转入只含有抑制农杆菌生长的抗生素（如羧芐青霉素或头孢霉素），不含选择压（如卡那霉素）的分化或愈伤组织诱导培养基中培养5 ～10 天

（称脱菌培养），然后再转入具有选择压的筛选培养基中进行抗性筛选。延迟筛选的好处是转化细胞受非转化细胞滋养有利于成活，缺点是常造成“逃逸”（假转化）现象及嵌合体出现。

（三）CpTI 基因叶盘法转化甘蓝

材料︰

（1）农杆菌LBA4404 ( pRCL27 ）。

（2）甘蓝种子。

操作︰

1．受体材料准备︰甘蓝种子用水漂洗，70 ％乙醇消毒1 分钟，0.1 ％的升汞消毒20～30 分钟，无菌水冲洗5 遍。播种于无菌0.7％固体琼脂培养基上，阳光下培养6～7 天。

2.配制培养基

预培养培养基︰MS + IAA0.2 + BA2.0

共培养培养基︰同上

脱菌培养基︰MS + IAA0.2+ BA2.0＋Cef 500mg / L

筛选培养基︰MS+ IAA0.2+ BA2.0+ Cef 500mg / L 十Km 25mg / L

生根培养基︰1 / 2 MS + IBA 0.5 十Km 25mg / L

抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高压灭菌后冷至50 ℃左右的培养基中，用力摇匀（可将磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后，置磁力搅拌器上搅匀）后分装于无菌培养皿中，生根培养基分装于三角瓶中。

3.农杆菌培养

（1）挑取单菌落，接种于20mL YEB + Km 25mg / L + Rif 50mg / L 液体培养基中，27℃、180r/min培养过夜。

（2）取400μl 菌液转接入20mL 无抗生素的YEB 液体培养中，继续培养4～6 小时。 （3）在超净工作台上，将菌液倒入无菌带鄞髐葴牏满A诱W管说A用石蜡膜封口，4000r/min 离心5 分钟。

（4）取出离心管，在超净工作台上弃去上清。向离心管内加入适量无菌MS 液体培养基，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用MS 液体培养基稀释至OD600 0.2 。

4.叶盘法转化

（1）取培养6～7 天的甘蓝无菌幼苗，将胚轴剪成5～8mm 长的小段，子叶带子叶柄剪下，转入预培养培养基中，于25℃，光照条件下预培养2 天。