一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项

文读懂  免疫组化步骤、结果分析及注意事项

导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分

文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话：

是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是

项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。

如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）

和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。

1.对照染色

和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照

般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身

对照。般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照

就足够了。

2.定位

抗原表达必须在特定部位。如LCA 应定位在细胞膜上；CK

应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

3.半定位

现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。

因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的

半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和

x 2 +（+++）% x 3 计算出数值；总数值 图像分析仪 如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析

仪。图像分析 仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐 的是一款图像分析软件：Image J 。毛博当年在米国做博士猴

的时候，就是用的这款软件。这是 NIH 开发的免费软件 般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到 了 1.50 版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图所 示。现在，根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行图像 分析。如下图所示， 我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。 那么，如何用Image J 来计数细胞的个数呢？首先，要把彩

色的图像转换成黑白图像。 步骤如下：Image 宀Type 宀16-bit 。 转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。步骤 如下：Image 宀Adjust 宀Threshold 。然后拖动鼠标，直到所有 的细胞被标示出来。有时候 2 个细胞靠得比较紧密，会被计 数为1个细胞。这个时候可以采用 Image J 的水洗功能。步

骤如下：Image 宀Binary 宀Watershed 。如下图的蓝色箭头所示， 这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地 被计数成了 2 个细胞。然后，就可以正式开始分析了。步骤 如下：Analyze 宀Analyze Particles 。在得出最后的结果之前，

亮绿色耀眼荧光。弱（ +）=1 ， 中（ ++ ）

=2，强（ +++） =3。 至少随机观察5-10个HPF 。然后根据（

+)% x 1 +(++)% 1.5 者为 (+++) 。 4.

还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞，那么Size

项里面选择“0-infinity ”。Circularity 的默认值为“ 0.00-

1.00”。

般就取默认值。最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72 个细胞，总面积为21286.00，

平均大小为295.64。免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，

还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望

得出自己想要的结果。以上，毛博介绍了些自己的心得体会。希望广大的实

验狗们都能做出自己想要的结果，早点发文章。非特异性染色的八大原因然而，结

果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的体问题，真的是

一分钱一分货啊！

张片子染得脏脏的，这就是最常见的非特异性染色。 1. 抗抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。

真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体的有效期。

2. 抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也是出现非特

异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做

预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。另一个常

见原因就是孵育时间过长。

解决的办法就是定时器。加上抗体后，立刻调好定时器，提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。

3. DAB 染色时间太长/变质DAB 的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。DAB 的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。DAB 要保存于避光干燥

的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。图1就冲洗的有

些晚了；图2 就是刚刚好，染色效果棒棒哒!4. 内源性酶和生物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。

处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑(24 mg/mL )加入底物液中，并保持PH 值在7.6-8.2，即

能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用

50 mmol/L 的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用

0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸

于25卩g/mL亲和素溶液中15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即

可染色。也可以24 mg/mL 的卵白素封片15分钟。

5. 组织变干

子染太多片子的时候，容易出现这种情况。解决的办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画