基于16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响

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基于16S_rDNA_高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用

846　环球中医药2023年5月第16卷第5期　Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5㊃基础研究㊃基金项目:福建省自然科学基金面上项目(2020J01724);福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2019⁃ZQN⁃82);福建省科技厅省属公益类科研院所基本科研专项(2021R1003001)作者单位:350122　福州,福建中医药大学针灸学院[王婧雯(硕士研究生)㊁林晟];福建省中医药科学院经络研究所福建省经络感传重点实验室(郑淑霞㊁许金森)作者简介:王婧雯(1995-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂E⁃mail:wjw951201@通信作者:许金森(1963-),硕士,研究员,博士生导师㊂研究方向:经络感传与针灸的作用机制研究㊂E⁃mail:xujinsenjls@基于16S rDNA 高通量测序研究电针对腹泻型肠易激综合征大鼠肠道菌群的调节作用王婧雯　郑淑霞　林晟　许金森【摘要】　目的　采用16S rDNA 高通量测序技术,分析电针足三里对腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)大鼠肠道菌群物种相对丰度和多样性的影响,探讨电针对IBS⁃D 的作用机制㊂方法　将SD 大鼠随机分为空白组㊁模型组㊁电针组㊂采用束缚联合番泻叶煎剂灌胃法造模,电针组采用电针双侧足三里干预,空白组与模型组不做干预处理㊂干预结束后,检测大鼠内脏敏感性,并取大鼠粪便进行16S rDNA 高通量测序技术检测大鼠肠道菌群㊂结果　(1)与空白组比较,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P <0.05);经过电针治疗后,在20mmHg 压力下的腹壁回撤反射评分明显降低(P <0.05)㊂(2)与空白组相比,模型组OTU 数目明显降低,电针组接近于空白组㊂(3)与空白组相比,模型组芽孢杆菌纲㊁乳杆菌属㊁真杆菌属等丰度明显降低,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲㊁毛螺菌属等丰度明显升高,而电针组上述菌纲/属丰度均有所改善㊂(4)三组的Beta 多样性分析结果显示,模型组与空白组的样本明显被区分开,而电针组则在两组之间㊂结论　IBS⁃D 与内脏高敏感性以及肠道菌群结构紊乱有关,电针能调节IBS⁃D 大鼠内脏敏感性以及肠道菌群物种相对丰度,改善菌群多样性㊂【关键词】　16S rDNA 高通量测序;　电针;　腹泻型肠易激综合征;　肠道菌群;　足三里;　内脏敏感性【中图分类号】　R245　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.05.005Regulatory effect of electropuncture on gut microbiota of rats with IBS⁃D based on 16S rDNA high⁃throughput sequencingWANG Jingwen ,ZHENG Shuxia ,LIN Sheng ,XU JinsenCollege of Acupuncture and Moxibustion ,Fujian University of Traditional Chinese Medicine ,Fuzhou 350122,ChinaCorresponding author :XU Jinsen ,E⁃mail :xujinsenjls@【Abstract 】　Objective To analyze the effect of electroacupuncture at zusanli on the relativeabundance and diversity of gut microbiota in rats with irritable bowel syndrome⁃diarrhea (IBS⁃D)by 16SrDNA high⁃throughput sequencing and explore the mechanism of action of electroacupuncture on IBS⁃D.Methods The SD rats were randomly divided into a blank group,a model group,and anelectroacupuncture group,and IBS⁃D rat model was established by chronic restraint stress combined withsenna.The electroacupuncture group took the double⁃sided zusanli point for electroacupuncture环球中医药2023年5月第16卷第5期　Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.5847　intervention,and the blank group and the model group were not treated with any treatment.After the inter⁃vention,the levels of visceral sensitivity were tested and rat feces were taken for16S rDNA high⁃throughput sequencing technology to detect the gut microbiota of rats.Results　(1)Compared with the blank group,The AWR socre of rats in the model group was significantly increased(P<0.05);after electroacupuncture treatment,the AWR score at20mmHg pressure was significantly decreased(P<0.05).(2)Compared withthe blank group,the number of OTU in the model group was decreased significantly,and the electroacupuncture group was close to the blank group.(3)Compared with the blank group,the abundance of Bacilli,Lactobacillus and eubacterium⁃coprostanoligenes_group in the model group was de⁃creased,and the abundance of Bacteroidia,Clostridia,Deltaproteobacteria,and lachnospiraceae_nk4a136_group were significantly increased,while the abundance of the above⁃mentioned class/genus inthe electroacupuncture group was improved.(4)The results of the beta diversity analysis of the threegroups showed that the samples of the model group and the blank group were clearly distinguished,whilethe electroacupuncture group was between the two groups.Conclusion　IBS⁃D is associated with high sensitivity of internal organs and disorders in the structural of gut microbiota,and electroacupuncture canregulate the visceral sensitivity and the relative abundance of gut microbiota species in IBS⁃D rats andimprove the diversity of microbiota.【Key words】　16S rDNA high⁃throughput sequencing;　Electroacupuncture;　Irritable bowel syndrome⁃diarrhea;　Gut microbiota;　ST36(Zusanli);　Visceral sensitivity 腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome⁃diarrhea,IBS⁃D)是一种反复发作㊁缠绵不愈的慢性功能性肠病,其在临床上的特征主要是腹泻㊁腹痛或腹部不适,根治较难㊂目前了解到的发病机制有胃肠功能紊乱㊁脑肠轴紊乱㊁内脏高敏感性㊁肠道菌群失调等㊂有研究发现,肠道菌群失调与IBS⁃D的发生发展关系密切,IBS⁃D患者的肠道菌群与正常人相比存在明显差异,常表现为有益菌减少,有害菌增多[1]㊂临床在治疗IBS⁃D时采取了很多方法,然而效果却不尽如人意,针灸以其安全有效简便的优点在众多治疗方法中崭露头角㊂近几年的研究发现,电针不仅可以改善IBS⁃D患者的各项症状[2],降低内脏高敏感性[3⁃4],而且对于改变肠道菌群结构也有一定帮助[5],但是对于其中具体的分子机制仍存在疑惑㊂课题组前期研究已经表明电针对于IBS⁃D大鼠具有良好的治疗效果,能够缓解大鼠症状,且对于辣椒素受体(TRPV1)以及蛋白酶激活受体⁃2(partition defective protein⁃2,PAR⁃2)通路有影响,但具体对大鼠肠道菌群的影响没有做出研究,故本研究拟在前期研究基础上,从肠道菌群角度探讨电针足三里治疗IBS⁃D的机制㊂1　材料与方法1.1　动物选用体质量为(200±20)g雄性SPF级SD大鼠25只,由杭州医学院提供[许可证号:SCXK (浙)2019⁃0002],于福建省中医药科学院实验动物中心饲养㊂饲养条件:室温26℃左右,湿度60%左右,自由饮食,适应性喂养一周后开始实验㊂本实验严格按照‘实验动物管理条例“等文件要求进行㊂1.2　仪器㊁设备R407型小动物呼吸麻醉机(深圳瑞沃德生命科技公司)㊁电针仪(华佗牌SDZ⁃Ⅱ型)㊁0.25×13mm 的毫针(北京汉医医疗器械有限公司)㊂1.3　实验药品和试剂番泻叶饮片(豪州市华鑫中药饮片科技有限公司)㊁异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)㊁0.9%氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司)㊂1.4　动物分组及处理按照随机数字表法将大鼠分为正常组8只㊁模型组8只㊁电针组9只㊂正常组不做处理,正常饮水进食;模型组和电针组进行为期两周的造模后,对电针组做电针干预处理,模型组做同等抓取,不做电针处理㊂1.5　模型制备采用慢性束缚应激联合番泻叶灌服法进行造模[6⁃7],具体操作方法:动物实验前10小时禁食不禁水,先给予番泻叶煎剂(0.3g/mL)灌胃给药(10mL/kg),每日1次,连续灌胃14天㊂灌服完番泻叶煎剂后,即用自制铁丝网将大鼠固定1小时,期间限制大鼠活动,每日1次,持续14天㊂848　环球中医药2023年5月第16卷第5期　Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.51.6　干预方法造模结束后,电针组选择双侧足三里”穴进行针刺干预㊂参照‘实验动物针灸穴位图谱“进行定位,选取位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处的足三里”穴㊂具体方法:采用自制固定器固定大鼠,暴露大鼠足三里的穴区,用0.25mm×13mm毫针直刺,深度5mm,进针后不需要进行手法刺激,连接电针仪进行治疗,设置连续波[8],频率2Hz,电压2~5V,强度以大鼠不嘶叫为宜,电针20分钟,左右足三里交替进行,每日1次,连续5天㊂1.7　内脏敏感性检测检测前,大鼠禁食不禁水18小时,给予异氟烷麻醉各组大鼠后,用自制工具(三通管连接自制球囊㊁血压计㊁针筒)进行检测㊂在球囊上涂充足的液体石蜡后将球囊缓慢插入大鼠肛门约4.5cm处,然后把大鼠放进自制的20cm×8cm×8cm大小的亚克力透明盒中㊂等待大鼠完全清醒后,约30分钟左右检测大鼠的内脏敏感性㊂测量腹壁回撤反射评分(abdominal withdrawa reflex,AWR)时由针筒向球囊内注入空气,使血压计读数短时间内分别达到20㊁40㊁60㊁80mmHg㊂不同容积的压力每个持续20秒,重复3次㊂AWR评分标准[9]:0分,无明显行为变化;1分,大鼠身体不动或仅有简单的头部运动;2分,大鼠腹部肌肉开始收缩;3分,大鼠下腹壁抬离地面或明显收缩变平;4分,大鼠腹壁拱起或伴身体㊁骨盆躬起,臀部抬离地面㊂1.8　样本采集与指标检测干预结束后,大鼠禁食不禁水18小时,用高温烘烤过的手术器械进行操作㊂先将大鼠放入小动物呼吸麻醉机诱导盒中使其吸入异氟烷后至麻醉状态,接着于冰上迅速剪开大鼠的结肠组织,将留存在大鼠肠道内的粪便取出1到2颗装入备好的无酶EP管内,随后置于液氮中保存㊂实验结束后,将取材得到的大鼠粪便采用16S rDNA高通量测序技术进行肠道菌群的检测由北京博奥晶典生物技术有限公司完成㊂基本流程:从样品中提取总基因组DNA,进行16SrDNA区段扩增, PCR产品定量和鉴定,混合和纯化PCR产物,使用无链®DNA PCR样品制备法生成测序文库,测序结果最终进行生物信息分析㊂测序完成后,对测序得到的原始数据进行处理,随后基于有效数据进行OTUs聚类㊂根据OTUs 聚类结果,先做物种注释,接着进行Beta多样性分析,比较样本群落组成的相似性或差异性㊂粪便基因测序以及生物信息分析流程由北京博奥晶典生物技术有限公司提供,根据公司平台生成的数据和图片进行统计分析处理㊂1.9　统计学处理内脏敏感性检测结果采用SPSS23.0统计软件进行数据分析,实验所得结果为计量资料,经检验符合正态分布且方差齐,数据用均数±标准差(x±s)表述,多组比较采用单因素方差分析,采用LSD⁃t检验进行两两比较㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2　结果2.1　内脏敏感性检测结果由表1可以看出,与空白组相比,模型组大鼠腹壁回撤反射评分明显升高(P<0.05),提示造模成功㊂经过电针治疗后,与模型组相比,在20mmHg的压力下,电针组腹壁回撤反射评分明显降低(P<0.05),而在更大压力下的变化并不明显,说明电针可以有效改善IBS⁃D大鼠的内脏敏感性,对于更大压力变化不明显的原因有待进一步探索㊂2.2　OTU分类韦恩图通过三组样本的OTU分布,对样本的物种分布情况初步判断,如图1所示,空白组OTU个数共有2106,模型组共有1739个,电针组共有2047个OTU 数目;其中模型组与空白组相交叠的OTU数目明显低于电针组与空白组交叠数目㊂说明经过治疗后,电针组总OTU数目以及与空白组交叠数目均有所上升㊂表1　三组大鼠电针后不同压力下腹壁回撤反射评分结果(x±s)组别鼠只20mmHg40mmHg60mmHg80mmHg 空白组80.6675±0.0895 1.9988±0.1257 2.8338±0.0892 3.6675±0.0893模型组8 2.0000±0.0000a 3.0825±0.0540a 3.8750±0.0879a 4.0000±0.0000b电针组9 1.7411±0.2787ab 3.0756±0.1216a 3.8156±0.1125a 4.0000±0.0000b 注:与空白组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂环球中医药2023年5月第16卷第5期　Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5849注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂图1　三组大鼠OTU 分类韦恩图2.3　大鼠粪便菌群测序量分析Shannon 稀释曲线可以用来反应各样本在不同测序数量时的微生物多样性,如图2所示,各组大鼠OTUs 不会随着测序量增加而上升,曲线趋于平坦,说明可以反应该样本绝大多数微生物多样性信息,足够可靠㊂图2　三组大鼠粪便菌群测序量分析Shannon⁃Wiener 图2.4　大鼠粪便菌群物种组成分析根据OTU 聚类结果,分别在纲㊁属㊁种水平上发现,三组的肠道菌群群落结构基本相似,只是构成比有差异㊂通过比较三组大鼠的菌群物种分布情况,说明电针治疗可以改善菌群结构㊂在纲(class)水平上,拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁芽孢杆菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲四种菌纲丰度相对较高㊂与空白组相比,模型组拟杆菌纲㊁梭菌纲㊁δ⁃变形杆菌纲等均有升高,芽孢杆菌纲则明显降低㊂而电针组的菌群结构则在模型组的基础上有所变化㊂如图3A 所示㊂在属(genus)水平上,三组中排在前六位的菌属主要有乳杆菌属㊁lachnospiraceae_nk4a136_group(毛螺菌属)㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Eubacterium _coprostanoligenes_group(真杆菌属)㊁Ruminiclostridium_9㊁Ruminococcaceae_UCG.014等㊂与空白组相比,模型组乳杆菌属㊁真杆菌属明显降低,毛螺菌属㊁普雷沃氏菌Ga6A1属㊁Ruminiclostridium_9㊁Rumi⁃nococcaceae_UCG.014(瘤胃菌属)等明显升高㊂经过电针治疗后,可看出以上菌属丰度均有一定的改善㊂如图3B 所示㊂在种(species)水平上,模型组的菌种结构分布与空白组存在明显差异,其中约氏乳杆菌的占比明显减少,而隶属于灰色部分的其他菌种的占比明显增加,经过电针治疗后有所改善㊂如图3C 所示㊂2.5　大鼠粪便菌群多样性比较Beta 多样性分析用来比较不同样本在物种多样性方面的相似程度㊂采用bray curtis 的算法计算样本间的距离,得到主坐标(PCoA)分析的结果,从图4可看出模型组与空白组明显被区分开(P <0.05),电针组则在两组之间;且模型组㊁空白组的组内集群效果好,电针组较差㊂说明了电针组样本在向空白组靠近,电针可以改善IBS⁃D 大鼠模型的Beta 多样性㊂3　讨论依照自然属性分类,人体常见的几大细菌门主要为拟杆菌门㊁厚壁菌门㊁变形菌门㊁放线菌门等,大多数人肠道菌群中百分之九十九由这四种菌门组成,它们的丰度和构成比例对人们的健康影响极大[10]㊂有研究表明IBS⁃D 患者肠道菌群结构与健康人相比存在失调情况[11⁃12],其肠道微生物在粪菌移植治疗后,会出现菌群丰度增加㊁结构改变的情况[13]㊂近几年,很多学者将肠道菌群作为治疗IBS⁃D 的靶点,得到了较好的效果㊂IBS⁃D 患者的肠道微生物失调总结起来就是有害菌增加㊁有益菌减少[14],那么了解哪些有害菌增加,以及又有哪些有益菌减少是非常有必要的㊂目前,大多研究都认为,厚壁菌纲㊁拟杆菌门等丰度增加,乳杆菌属㊁双歧杆菌等丰度降低会引起IBS⁃D [15⁃17]㊂众所周知,IBS⁃D 患者的典型症状主要是腹痛㊁腹泻㊁腹胀等,这与内脏高敏感性相关[18],曾有学者提出其腹痛症状与肠道菌群结构关系密切,在于肠道菌群会产生能加重腹痛症状的乙酸盐[19];同时,也有人指出腹泻症状与某些菌群密切相关,可能是因为一些肠道850　环球中医药2023年5月第16卷第5期　Global Traditional Chinese Medicine,May 2023,Vol.16,No.5 注:K:空白组;M:模型组;D:电针组㊂图3　三组大鼠菌群物种分布比较图4　基于bray curites 距离的PCoA 分析菌群能够产生影响肠道渗透性的脂多糖[20]㊂因此,通过改善肠道菌群结构紊乱的情况,可以缓解IBS⁃D 的症状㊂本实验通过慢性束缚应激联合番泻叶灌服法构建IBS⁃D 大鼠模型,实验结果证明电针足三里可以通过改善大鼠肠道菌群结构达到治疗大鼠的目的㊂通过分析各组大鼠粪便菌群在不同水平上的物种组成的结果发现,IBS⁃D 大鼠粪便菌群的物种构成与空白组大鼠存在明显差异,这与其他人的研究结果一致[21⁃22]㊂本研究发现,乳杆菌属明显降低,且其中约氏乳杆菌种下降非常明显,乳杆菌属做为有益菌,可以对抗机体致病微生物,改善肠道屏障功能,预防和治疗腹泻㊂此外,本研究还发现模型组的普雷沃氏菌Ga6A1属丰度明显高于其他两组,Prevotellaceae_Ga6A1_group 隶属于普氏菌属,普雷沃氏菌可以加快碳水化合物发酵,诱发内脏超环球中医药2023年5月第16卷第5期　Global Traditional Chinese Medicine,May2023,Vol.16,No.5851敏反应,甚至可能通过增加肠道通透性的方式加剧腹痛腹泻的症状㊂基于此,普雷沃氏菌的增加与内脏高敏感性呈正相关㊂因此,乳杆菌属的降低㊁普雷沃氏菌的增加都可能是IBS⁃D的起病原因㊂本实验通过电针足三里穴发现,IBS⁃D大鼠具有内脏高敏的反应,且证实了其具体的内在机制可能与肠道菌群结构有关;明显可以看出模型组相较空白组而言有降低或增加的肠道微生物,在电针组中或多或少得到了改善㊂本研究证明了高通量测序技术可以满足大鼠肠道菌群的检测需求,为深入研究电针足三里穴治疗IBS⁃D提供了参考思路,但由于受客观条件的影响,并未对实验中改变明显的菌群进行功能预测,未来可进一步研究菌群的功能基因在代谢途径和蛋白功能上的差异和变化㊂参考文献[1]　王菲,高斌.腹泻型肠易激综合征患者的肠道微生态特征[J].临床合理用药杂志,2021,14(8):157⁃158. 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基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌

基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌
基于16SrDNA序列分析及特异PCR鉴定DVS中未知乳杆菌
目的:探讨EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂(DVS)未知乳杆菌的分子生物学鉴定方法.方法:采用显微观察初步鉴定,利用16SrDNA序列分析方法进一步鉴定,利用NCBI中BLAST数据库对测序结果进行比对,构建系统发育树进行分析,并对菌种进行特异PCR分析.结果:最终确定该未知乳杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus).结论:基于16SrDNA序列分析及特异PCR结合的方法可以快速、准确地的鉴定出未知乳杆菌.
作者：彭亚会高学军刘营PENG Ya-hui GAO Xue-jun LIU Ying 作者单位：彭亚会,PENG Ya-hui(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030;哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室,哈尔滨,150086)
高学军,刘营,GAO Xue-jun,LIU Ying(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,哈尔滨,150030)
刊名：生物技术 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2008 18(3) 分类号：Q93-331 关键词：EZAL-MY96 乳杆菌 16SrDNA 特异PCR 鉴定。

16SrDNA高通量测序技术分析油藏微生物多样性

16S rDNA高通量测序技术分析油藏微生物多样性*许颖1,2**马德胜1,2宋文枫1,2魏小芳1,21中国石油勘探开发研究院北京1000832提高石油采收率国家重点实验室北京100083摘要本研究以16S rDNA为分子标记，通过高通量测序技术对三口采油井的油藏微生物多样性进行了全面和深入的分析。

对三个DNA样本中细菌16S rDNA的PCR扩增产物进行高通量测序，得到123,360条优化序列，测序深度指数超过99.9%。

根据序列相似性进行聚类分析，得到139个OTU。

基于OTU的物种分类分析发现三个样本中的细菌种类覆盖91个属、29个纲和20个门，其中包括多种采油有益菌。

分别对各个样本的菌种组成和相对丰度进行分析，发现不同采油井的主要菌种组成和优势类群呈现出差异性。

结果表明，16S rDNA高通量测序能更加全面、准确和深入地反映油藏微生物多样性情况，为微生物采油技术提供有用和必要的背景信息。

图6表1参27关键词油藏；微生物多样性；16S rDNA；高通量测序CLC TE357收稿日期Received: 接受日期Accepted:*中国石油天然气股份有限公司科技攻关专项（2014A-1006）Supported by CNPC Programs f or Science and Technology Development (2014A-1006).**通讯作者Correspondingauthor(E-mail:*************************.cn)16S rDNA-assisted analysis of microbial diversity in oil reservoirs by NGS*XU Ying 1,2**, MA Desheng1,2, SONG Wenfeng1,2& WEI Xiaofang1,21PetroChina Research Institute of Petroleum Exploration & Development, Beijing 100083, China2State Key Laboratory of Enhanced Oil Recovery, Beijing 100083, ChinaAbstractObjectives:Indigenous microbial community in oil reservoirs has great influenceon the application ofmicrobial enhanced oil recovery technology (MEOR). This paper aims to obtain accurate information about microbial diversity in oil reservoirsby the aid of a recently developed next generation sequencing technology(NGS). In this study, NGSand application of 16S rDNA molecular marker were combined.Methods:Total DNA of three samples was extracted separately, followed by amplification of bacterial 16S rDNA fragment. PCR productswere sequenced on the Illumina Miseq platform.Sequencing datasetwith high quality was collected for further analysis. Identification of bacteria at different taxonomic levels was performed basedon the result of blast against annotated16S rDNA database. Microbial diversity ineach samplewas analyzed separately and comparison among them was alsoperformed.Results: 123,360 16S rDNA sequences with high quality were obtained and thesequencing coverage was more than 99.9%. These sequences were clustered into 139 OTUs. Bacterial species detected in these samples covered 91 genera, 29 classes and 20 phyla, including many groups beneficial for MEOR.Bacteria(e.g.,Arcobacter, Pseudomonas and Acinetobacter)that can utilize petroleum hydrocarbons as sole carbon sources were detected,eventhose with extremely low abundance.Moreover, the analysis of microbial community structure for each sample showeddifferentpatterns ofcomposition characteristicsand dominant groups.Conclusions:The results indicate that analysis basedon high-throughput sequencing data of 16S rDNA fragments is powerful in reflecting microbial community structure accurately and provides more information for MEOR compared to traditional methods.Keywords oil reservoirs; microbial diversity; 16S rDNA; high-throughput sequencing/ next generation sequencing (NGS)油藏环境是一种独特的生态环境，其中存在着丰富的微生物资源[1-3]。

16s rdna测序原理

16s rdna测序原理
16s rDNA测序原理是基于微生物的基因组学研究，它是
一种用于鉴定微生物物种的方法。

它以16s rDNA（核糖体rDNA）序列作为微生物鉴定的基础。

16s rDNA是一种普遍存
在于细菌和古菌核糖体中的核酸，具有一定的特殊序列，它们在不同物种之间有着显著的差异。

16s rDNA测序技术是一种利用这种序列息分析样本中微
生物组成的高通量分析技术。

它可以准确地检测到各种微生物，从而实现对样本中微生物的识别和定性分析。

细菌和古菌的16s rDNA测序可以从样品中提取16S
rDNA序列的基因序列，再利用PCR（聚合酶链反应）技术对16S rDNA序列进行扩增，然后再用测序仪对扩增的16S
rDNA序列进行测序，最后再利用计算机分析软件对测序结果
进行分析，从而得到样品中微生物的物种组成。

16s rDNA测序技术在微生物鉴定中非常重要，它是一种
快速、简便、高灵敏的方法，能够准确地识别出样品中的微生物，而不需要进行其他复杂的分析步骤，极大地提高了微生物鉴定的效率和准确性，可以用于环境监测、食品安全检测、医学检测等方面。

16s rDNA测序技术同时也可以用于微生物群落的多样性研究，可以检测样品中微生物种群的多样性，以及不同微生物之间的相互作用，为生态学研究提供重要的息。

总之，16s rDNA测序技术是一种灵敏、可靠、准确的微生物鉴定技术，它可以用于微生物的鉴定和多样性研究，为环境监测、食品安全检测、医学检测等方面提供重要的息，发挥着重要的作用。

奶牛乳房炎主要致病菌的分离鉴定及大肠杆菌噬菌体的生物学效应研究

奶牛乳房炎主要致病菌的分离鉴定及大肠杆菌噬菌体的生物学效应研究首先，研究人员收集了多个不同奶牛场的乳房炎样本。

样本的采集要求严格，以确保获取的样本是真正反映奶牛乳房炎症状的。

从不同样本中分离出的细菌会在特定培养基上进行进一步培养。

常用的培养基包括血琼脂、马都基琼脂等。

通过分离细菌的方式可以精确地确定致病菌的类型和数量。

在对分离出的细菌进行鉴定之前，研究人员利用不同的培养基和培养条件进行纯化。

纯化过程主要是将其他细菌和杂质与目标细菌分离，使得分离得到的细菌纯度更高。

常用的纯化方法有革兰氏染色、API试剂盒、PCR等。

通过纯化，研究人员可以获得清晰的细菌形态、生长特点和生理特性。

经过纯化后，研究人员对致病菌进行了进一步的分子鉴定。

目前，常用的分子鉴定方法主要包括16S rRNA测序技术、多重PCR技术等。

通过这些技术，研究人员可以准确鉴定奶牛乳房炎的致病菌。

在确定奶牛乳房炎主要致病菌的同时，研究人员也对大肠杆菌噬菌体的生物学效应进行了研究。

大肠杆菌噬菌体是一种寄生于大肠杆菌上的噬菌体，可以选择性地感染并杀灭大肠杆菌。

研究人员将大肠杆菌噬菌体与奶牛乳房炎患奶牛的分泌物进行接触实验，观察其对大肠杆菌的生物学效应。

实验结果显示，大肠杆菌噬菌体对大肠杆菌具有较高的选择性感染和杀灭能力。

在接触实验中，大肠杆菌噬菌体可以迅速繁殖并杀灭患奶牛分泌物中的大肠杆菌。

此外，大肠杆菌噬菌体还具有一定的溶菌能力，可以释放出一些有害细菌产生的毒素。

这些结果表明，大肠杆菌噬菌体在治疗奶牛乳房炎方面具有潜在的应用价值。

综上所述，奶牛乳房炎的致病菌鉴定是对该疾病研究的重要一步。

通过对致病菌的分离、纯化和分子鉴定，可以获得更多关于奶牛乳房炎病原菌的信息。

此外，大肠杆菌噬菌体对大肠杆菌的生物学效应研究为治疗奶牛乳房炎提供了新的思路和方法。

希望通过对奶牛乳房炎主要致病菌的深入研究，可以为奶牛养殖业的健康发展和生产提供更好的支持和保障通过6S rRNA测序技术和多重PCR技术，研究人员可以准确鉴定奶牛乳房炎的致病菌。

利用16SrRNA基因序列鉴定奶牛乳腺炎致病菌的技术方法 - 奶牛养殖

利用16SrRNA基因序列鉴定奶牛乳腺炎致病菌的技术方法-奶牛养殖奶牛乳腺炎是困扰奶牛业发展的四大疾病之首，是最常见、治疗花费最高的疾病之一，主要是由病原微生物在奶牛乳腺内感染引起的炎症反应。

据统计，我国每年因乳房炎造成的经济损失达135亿元。

可以引起奶牛乳房炎的微生物种类有很多，如细菌、病毒、真菌、支原体等，目前从患有乳房炎的奶牛乳汁中分离到了160多种微生物，以细菌感染比较多见，引发该疾病的致病菌主要有葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，这三种细菌引起的乳腺炎占总发病率的90%以上。

本研究中，通过对乳腺炎患牛乳汁的病原菌培养、分离及药敏试验后，得到乳腺炎致病菌株，通过对其16S rRNA基因的序列进行分析，为该株致病菌的研究提供参考。

1、材料与方法乳腺炎致病菌分离将乳腺炎患牛乳汁稀释后，分别接种到血琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，恒温培养，观察记录菌落形态、大小及溶血情况，接种到肉羊培养基中增菌培养。

分离菌株药敏试验将上述分离的致病菌分别接种到肉汤培养基培养，周围黏贴药敏片，培养24 h，观察抑菌直径。

细菌学鉴定及致病性确定采用生化与革兰氏染色镜检，确定耐药菌形态，并进行细菌学分类。

抽取分离培养后的菌液500 μL，腹腔注射健康小鼠，24 h后观察小鼠发病情况，如小鼠死亡则认定该菌株具有致病性。

细菌16S rRNA基因克隆与测序使用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌液进行基因组DNA的提取，后利用细菌16S rRNA基因通用引物（F：5 7- AGAGTTTGATCMTG-GCTCAG - 3&acute;; R:5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）进行细菌16S rRNA基因PCR扩增（扩增体积为50lJL;条件为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后72℃终延伸10 min，4℃结束反应），电泳以及胶回收后，连接pMD - 18T载体连接克隆，经过筛选后将有16S rRNA基因序列插入的质粒提取测序。

基于16S rRNA高通量测序技术分析安格斯牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究

基金项目：内蒙古自治区“草原英才工程”青年创新创业人才第一层次培养项目（Ｑ２０１７０２２）；内蒙古自治区自然基金面上项目　（２０１８ＭＳ０３０２２，２０１７ＭＳ０３４２）；内蒙古自治区自然基金项目（２０１８ＬＨ０３０１３）；内蒙古自治区科技创新引导项目（ＫＪＣＸ１７０３）　作者简介：吴琼　女，硕士研究生。

研究方向为动物营养与饲料科学。

Ｅｍａｉｌ：ｗｕｑｉｏｎｇ＿０４１２＠１６３．ｃｏｍ通讯作者。

王思珍，男，教授，硕士生导师。

研究方向为动物营养与饲料科学。

Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｓｉｚｈｅｎ＠ｉｍｕｎ．ｅｄｕ．ｃｎ　牛化欣，男，教授，硕士生导师。

研究方向为动物营养与生物饲料高效利用。

Ｅｍａｉｌ：ｎｉｕｈｘ＠ｉｍｕｎ．ｅｄｕ．ｃｎ　收稿日期：２０１９１１０１基于１６ＳｒＲＮＡ高通量测序技术分析安格斯牛瘤胃微生物多样性和功能预测的研究吴　琼１，王思珍１，张　适１，尤　欢２，胡宗福１，牛化欣１（１．内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽　０２８０００；２．通辽市家畜繁育指导站，内蒙古通辽　０２８０００）摘　要　本研究旨在系统探索和分析安格斯牛瘤胃微生物多样性及其基因功能。

选用体重５５０ｋｇ左右的安格斯牛６头分成２组，利用基于１６ＳｒＲＮＡ高通量测序技术检测牛瘤胃液样本进行组学分析。

结果表明，２组样本通过ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉｓｅｑ测序平台共获得８６２９８条高质量优质序列，聚类为３４６个操作分类单元（ＯＵＴ），经分类学鉴定分属１３个门，２１个纲，２４个目，４０个科，１２３个属。

拟杆菌门（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）４３１６％和厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）３６．２９％为优势菌群。

基于属的组成，依次为普雷沃氏菌属＿７（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ＿７）２９．２８％、琥珀酸弧菌科＿ＵＣＧ００１（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ＿ＵＣＧ００１）１１．３０％、琥珀酸菌属（Ｓｕｃｃｉｎｉｃｌａｓｔｉｃｕｍ）１１．１０％、普雷沃氏菌属＿１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ＿１）６．６５％、瘤胃球菌属＿１（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿１）５．１７％、琥珀酸弧菌属（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ）２．７５％等。

16SrDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性

第5卷第10期食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 102014年10月Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014基金项目: 国家质检总局科技计划项目(2011IK228)Fund: Supported by Science and Technology Planning Project of Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine(2011IK228) *通讯作者: 张建军, 高级工程师, 主要研究方向为微生物检测。

E-mail: jianjunn@*Corresponding author: ZHANG Jian-Jun, Senior Engineer, Technical Center of Shanxi Entry-Exit Inspetion and Quarantine Bureau, No.8 of Yifen Street, Taiyuan 030024, China. E-mail: jianjunn@16S rDNA 克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性张敏爱1, 张建军1*, 王子亮2, 苑利1, 杨秀清3(1. 山西出入境检验检疫局技术中心, 太原 030024; 2. 中国合格评定国家认可中心, 北京 100062;3. 山西大学生物技术研究所, 太原 030006)摘要: 目的利用16S rDNA 基因文库分析法, 对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。

方法提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA 为模板, 将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA 的PCR 产物与pMD~18T 载体连接, 构建其菌群的16S rDNA 文库。

对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST 比对。

结果文库序列分析表明, 有53个克隆子分属3个不同的类群, 即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群,其余3个克隆子属于未知类群。

基于16S rDNA测序检测原发性胆汁性胆管炎患者肠道菌群的变化

基于16S rDNA测序检测原发性胆汁性胆管炎患者肠道菌群的变化作者：王广宇陈潇潇侯显良来源：《中国现代医生》2021年第19期[關键词] 原发性胆汁性胆管炎;16S rDNA;肠道菌群;高通量测序[中图分类号] R575.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2021）19-0139-05Detecting changes of intestinal microflora in patients with primary biliary cholangitis based on 16S rDNA sequencingWANG Guangyu1 CHEN Xiaoxiao2 HOU Xianliang11.Central Laboratory， Guangxi Health Commission Key Laboratory of Glucose and lipid Metabolism Disorders， the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin541199， China; 2.State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases， the First Affiliated Hospital， College of Medicine，Zhejiang University， Hangzou 310006， China[Abstract] Objective To study the abundance and diversity of intestinal flora in Primary biliary cholangitis （PBC） patients. Methods Nine patients with primary biliary cholangitis addmitted in the First Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College from January 2018 to January 2019 were selected as research subjects. Another 8 healthy subjects were selected as healthy controls. The intestinal flora DNA was extracted， and the corresponding gene fragments of V3-V4 region were amplified by high-throughput 16S rDNA sequencing， and the database was constructed for sequencing and bioinformatics analysis. Results In Alpha diversity analysis， there were no significant differences in ACE index， Chao index， Simpson index and Shannon index between the two groups（P>0.05）. Through OTU clustering and species annotation， we found that there were statistical differences in the abundance of some flora between the two groups （P<0.05）. Compared with healthy control group（NC）， Cellulosilyticum， Holdemanella， Lachnospiraceae，Lactococcus and Morganella were decreased and Hungatella was significantly increased in PBC group. In addition， real-time quantitative PCR was used to detect the content of intestinal Escherichia coliin the PBC group and the NC group， and it was found that the content in the PBC group was significantly higher than that in the NC group （P<0.05）. Conclusion Compared with healthy control group（NC）， the primary biliary cholangitis（PBC）group shows changes in intestinal flora to a certain extent. Further analysis of changes in intestinal flora is expected to provide new ideas for the study of the occurrence and development of primary biliary cholangitis and the search for new sensitive microbial markers.[Key words] Primary biliary cholangitis; 16S rDNA; Intestinal flora; High-throughput sequencing原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis，PBC）是一种具有器官特征性的慢性免疫疾病。

基于16S rDNA高通量测序方法比较新疆西北部地区乳品中微生物的多样性

基于16S rDNA高通量测序方法比较新疆西北部地区乳品中微生物的多样性张敏;张艳;黄丽丽;刘忆冬;周红;倪永清【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2017(038)020【摘要】为更加全面地了解新疆特色乳品中微生物多样性,比较不同动物来源的原奶和酸奶的细菌群落结构,运用高通量测序技术,对乳品中细菌16S rDNA V4-V5区测序,进而对新疆克州和塔城地区牛奶、驼奶、马奶、羊奶、酸牛奶、酸驼奶和酸马奶7种乳品中细菌群落组成和多样性进行分析.研究共获得539 557条有效序列,379个OTU.多样性分析表明,原奶样品中细菌Shannon-Wiener指数明显高于酸奶样品.微生物群落组成分析发现,不同乳品之间菌群组成差异较大.7种乳品中的菌群均以厚壁菌门和变形菌门为主,但原奶样品主要以变形菌门为主,而酸奶样品主要以厚壁菌门为主.在属水平上,牛奶主要以假单胞菌属(Pseudomonas)为主,驼奶主要以埃希菌属-志贺菌属(Escherichia-Shigella),马奶主要以明串珠菌属(Leuconostoc)为主,羊奶中的优势菌属为乳球菌属(Lactococcus),而酸牛奶、酸驼奶和酸马奶都是以乳杆菌属(Lactobacillus)为优势菌属.不同动物来源的原奶和酸奶样品中的微生物多样性存在显著差异,并且原奶中检测到的环境污染菌和致病菌(或条件致病菌)的丰度也相对较高.本研究结果将为准确评估乳品中的微生物群落对新疆地区少数民族健康的影响提供一定的数据基础.【总页数】7页(P27-33)【作者】张敏;张艳;黄丽丽;刘忆冬;周红;倪永清【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;石河子大学食品学院,新疆石河子 832000;石河子大学食品学院,新疆石河子 832000【正文语种】中文【中图分类】Q935【相关文献】1.基于16S rRNA高通量测序方法比较新疆冷水鱼肠道中微生物多样性 [J], 黄丽丽;张艳;周红;倪永清2.16S rDNA克隆文库法与高通量测序法在浓香型大曲微生物群落结构分析中的对比研究 [J], 陈玲;袁玉菊;曾丽云;廖作敏;陈伊童;吴正云;张文学3.基于16S rDNA高通量测序的玉米根际与非根际土壤细菌多样性比较 [J], 徐丽霞;何永吉4.基于16S rDNA高通量测序技术分析北京豆汁儿微生物多样性和功能预测的研究 [J], 袁钰;李静;林少华;贾红亮;潘妍;罗红霞;邓毛程5.基于16S rDNA高通量测序分析水牛初乳与常乳中细菌多样性 [J], 谢芳;谢华德;唐振华;谢耀锋;郭艳霞;黄钰涵;杨承剑因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于高通量测序分析年糕菌群结构和优势菌属

基于高通量测序分析年糕菌群结构和优势菌属蔡怀依;雷丽萍;娄永江;李勇勇【期刊名称】《中国粮油学报》【年(卷),期】2018(033)008【摘要】结合宏基因组DNA进行高通量测序,分析新鲜年糕菌群结构和优势菌属.使用Usearch等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTU)数量,分析内生细菌的丰度和α-多样性,获得了用于分析的有效序列25 896条,OTU数为81.稀释曲线表明测序深度充分,OTU数量接近于饱和.年糕样品的Chao1指数为90.23,Shannon多样性指数为1.80.基于OTU的物种分类分析,年糕内生细菌种类覆盖29个属8个纲5个门,其中年糕内生细菌优势菌属为玫瑰色半光合菌属(Roseateles,36.75％)、芽胞杆菌属(Bacillus,24.38％)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas,9.36％).【总页数】7页(P112-118)【作者】蔡怀依;雷丽萍;娄永江;李勇勇【作者单位】宁波大学海洋学院,宁波315211;宁波大学海洋学院,宁波315211;宁波大学海洋学院,宁波315211;宁波大学海洋学院,宁波315211【正文语种】中文【中图分类】TS202.3【相关文献】1.基于16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响[J], 郭婷婷;胡丹丹;付子琳;李娜;徐晓锋2.基于高通量测序分析虾夷扇贝柱菌群结构及腐败优势菌 [J], 江艳华;王联珠;许东勤;李风铃;翟毓秀;张媛;姚琳3.基于高通量测序分析急性白血病患者与健康人群口腔菌群结构的变化规律以及差异性 [J], 任乐; 李大旭; 张喆; 徐纪茹4.基于高通量测序分析储藏稻谷中的真菌群落结构与优势菌属 [J], 徐圆程;刘慧;王光宇;吴红影;邱伟芬5.基于高通量测序分析早产认知障碍大鼠肠道菌群结构特征 [J], 乐涛;卢红艳;薛正阳;徐苏晴;唐炜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于16S rRNA测序分析奶牛体外发酵中瘤胃细菌多样性的变化

基于16S rRNA测序分析奶牛体外发酵中瘤胃细菌多样性的变化李烨青;奚雨萌;曾涵芳;张林;陈孟姣;韩兆玉【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2018(030)010【摘要】本试验旨在通过16S rRNA测序技术,分析奶牛体外发酵瘤胃微生物区系随时间推移的变化规律,为探究瘤胃微生物繁殖规律及完善体外发酵分析方法提供支持.试验使用体外产气法进行发酵.采集3头健康奶牛的新鲜瘤胃液,与人工唾液混合后,注入盛有发酵底物的发酵瓶,39℃ 水浴振荡培养,分别于0、6、12、24、48 h采集发酵液,用16S rRNA测序技术分析瘤胃细菌变化规律.结果表明:1)所有的序列被鉴定为14个门和59个属.随着时间的变化,在门水平上,纤维杆菌门(Fibrobacteres)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和黏胶球形菌门(Lentisphaerae)的相对丰度减少,纤维杆菌门、拟杆菌门在48 h时显著低于其他时间点(P<0.05),黏胶球形菌门在24 h时显著低于其他时间点(P<0.05).而螺旋体门(Spirochaetae)和变形菌门(Proteobacte-ria)的相对丰度增加,螺旋体门在48 h时显著高于其他时间点(P<0.05),变形菌门在12、24、48 h时显著高于其他时间点(P<0.05);随着时间的变化,在属水平上,丁酸弧菌属(Butyrivibrio)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的相对丰度增加,均在48 h时显著高于其他时间点(P<0.05);而解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)和普雷沃氏菌属(Prevotella)的相对丰度则减少,解琥珀酸菌属在24、48 h显著低于其他时间点(P<0.05),普雷沃氏菌属在48 h时显著低于其他时间点(P<0.05).2)试验获得15792个操作分类单位(OTU)并进行多样性分析,稀释曲线达到平台期;Simpson指数和Shannon指数均表明菌群丰度具有先降低后升高的趋势.综上所述,奶牛瘤胃体外发酵过程中,瘤胃细菌主要的门以及属的相对丰度以及多样性均随时间推移发生改变,且因瘤胃细菌功能差异在发酵过程的变化更为显著.因此,在使用体外发酵法进行研究时,应充分考虑瘤胃细菌的功能差异与底物以及人工唾液的营养物质减少引起的发酵环境变化的关系.【总页数】12页(P4059-4070)【作者】李烨青;奚雨萌;曾涵芳;张林;陈孟姣;韩兆玉【作者单位】南京农业大学动物科技学院,南京 210095;南京农业大学动物科技学院,南京 210095;南京农业大学动物科技学院,南京 210095;南京农业大学动物科技学院,南京 210095;南京农业大学动物科技学院,南京 210095;南京农业大学动物科技学院,南京 210095【正文语种】中文【中图分类】S823【相关文献】1.基于16s rRNA高通量测序分析糖尿病足骨髓炎感染骨组织中的病原微生物 [J], 胡萍;邹梦晨;曹瑛;潘彦伶;罗祥蓉;蒋娅;薛耀明;高方2.基于16S rRNA基因序列分析梅花鹿瘤胃细菌多样性 [J], 李志鹏;刘晗璐;崔学哲;荆祎;鲍坤;徐超;杨福合;李光玉3.基于16S/18S rRNA/rDNA的分子技术在定量瘤胃微生物中的研究进展 [J], 邓卫东;成玉梅;陈静;褚柯;王利平;毛华明4.基于16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响[J], 郭婷婷;胡丹丹;付子琳;李娜;徐晓锋5.基于16SrRNA基因测序技术研究低聚异麦芽糖对奶牛瘤胃细菌菌群的影响 [J], 郭成;郭婷婷;胡丹丹;张力莉;徐晓锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖组合对锦江黄牛瘤胃液细菌多样性的影响

本试验在上述前期研究基础上，采用自身对照的方法进行体内试验。试验分 2 期进行，第 1 期：对照期，饲喂基础饲粮，不添加任何寡糖。第 2 期：添加期，饲喂基础饲粮组合＋GTI 。按照每头牛每天饲喂精饲料 1.2 粗 kg、饲料 4.8 计 kg，算功能性寡糖添加量，得到甘露寡糖 48 g/d、果寡糖 60 g/d和大豆寡糖 48 g/d，与每日所需饲喂的精饲料混匀，于 08：00 和 20：00 各饲喂 1 /2。每期持续
为瘤胃液细菌沉淀， -80 ℃冰箱保存备用。
1.4 主要试剂和仪器
甘露寡糖购自北京奥特奇生物制品有限公
司，其有效成分含量大于 90%。果寡糖购自河北
维尔康制药有限公司，其有效成分含量大于 92%。
大豆寡糖购自陕西森弗生物技术有限公司，其纯
度约为 98%。提 DNA 取试剂盒购自北京天恩泽
公司，Taq DNA聚合酶及反 PCR 应缓冲液购自日
ues， according to breeding standard ofbeefcattlein China
（ NY815—2004） .
1.5 细菌基因组 DNA提取和 PCR扩增
DNA提取：参照 DNA提取试剂盒说明提取
瘤胃液细菌于 DNA，DNA -20 ℃保存备用。
扩 PCR 增参照 Wang 等[9] 方法，利用细菌通
本试验通过对瘤胃细菌的16srdna片段进pcrdgge分析后发现添加功能性寡糖对瘤胃液细菌区系有明显影响增加了瘤胃液细菌的条带数说明提高了瘤胃微生态系统中的细菌多这可能是因为功能性寡糖作为营养物质促进了反刍动物部分瘤胃液细菌增长使其成为瘤胃内优势菌群有助于瘤胃细菌生长发酵和功能的营养调控18一般认为当瘤胃微生态系统中的细菌多样性愈高时该系统愈难以因外界因素而失调也更愈稳定而一个稳定的瘤胃生态系统无疑是对宿主健康有利的19添加功能性寡糖提高了瘤胃微生态系统中的细菌多样性可能有利于瘤胃健康和发酵功能的提高

不同16SrDNA引物对肠道菌群分析差异的比较

论著不同16S rDNA引物对肠道菌群分析差异的比较李娟孙强正叶长芸徐建国摘要目的分析不同16s rDNA 通用引物扩增靶序列在研究肠道微生物菌群分析时的差异,为选择合适的通用引物扩增肠道微生物菌群提供基础数据。

方法从一健康成人的粪便中提取总DNA,以两对通用引物27F/519R和27F/533R扩增16S rDNA序列,扩增产物分别克隆到PGE M-T载体,建立克隆文库;两个克隆文库分别挑取65个克隆进行测序,通过序列同源性比对和构建系统发育树,比较两对引物在分析肠道菌群多样性上的差异。

结果成功构建了L519和L533克隆文库,阳性克隆率分别达到95 3%和92 3%。

533文库和519文库中非培养或不可培养的克隆比例分别占69 1%和76 6%(P<0 05)。

两文库优势菌群相同,均为梭状芽孢杆菌、拟杆菌、芽孢杆菌和变形杆菌,但各菌群的比例及低丰度菌群的分布稍有差异;在种群多样性上,533文库和519文库中分别得到22个和17个可操作分类单元,533文库比519文库有更丰富的种群多样性(P<0 05)。

结论在分析肠道菌群多样性时,引物27F/533R较27F/519R有更好的兼并性,更适宜于进行肠道菌群结构和多样性的分析。

关键词 16S r DNA;引物;粪便;菌群多样性中图分类号 R511.7 文献标识码 A 文章编号 1006-2483(2010)03-0005-05Co mparison of two sets of un i versal p ri m er s of16S r DNA by anal ysis of m icrob ial co mmun ities of stoolsa mp les L I Juan,SUN Q iang-zheng,YE Chang-yun,X U J ian-guo. State K e y Laboratory for Infectious D isease Preventi on and Control,N ational Instit u te for Co mmun icableD isease Control and P revention,China CDC,Beijing 102206, ChinaCorres p onding author:X U J i an-guo,Email:xujianguo@Ab stract O bjective T o co m pa re the t wo sets o f un i ve rsal pr i m ers of16S rDNA by investi ga ting t he d iffe rence o fm i crobial co mm un iti es o f stoo l sa m ples based on t he a m plificati on products.M ethod s The to tal of DNA fro m the stoo l o f a healthy adult w as ex tracted and used as temp l a te to a m plify the conserved reg ion of16S r DNA w ith t w o se ts of pri m ers (27F/519R and27F/533R).A fter pur ificati on,the PCR products w ere c l oned i nto PGE M-T vecto rs and sequenced.T he obta i ned sequences w ere b l asted i n G enbank to ana l y ze the co mmun ity structure of bacter i a.Resu lts T he L519c l oneli brary based on pr i m ers27F/519R and the L533c l one li brary based on pr i m ers27F/533R w ere successfull y constructed.T he cove rage of positi ve clones attached to95 3%and92 3%respectively.Am ong65c l ones of each li brary,62and60 positi ve clones w ere obta i ned respecti v ely i n L519li brary and i n L533li brary.T he sequence analysis i nd ica ted that t he t woli braries had si m ilar propo rti on o f predom i nant species i nc l ud i ng C l ostr i d i a,Bactero i detes and Bac ill.i A s for m i nor spec ies, there we re d ifferences bet ween the t wo li braries.A c l one belong i ng to Be taproteobacteria was detected i n L533li brary,butnot i n L519li brary.M eanwh ile a c l one o f unclass ified bacte ria was detected i n L519library,but no t i n L533li brary.T he number o f opera ti ona l taxonom ic un its(OUT s)i n L519li brary and i n L533li brary w ere17and22respecti ve l y (P<0 05).F urt her m ore,t he frequenc ies of c l ones be l ong i ng to uncultured or unknown bacter ia i n L519library and i nL533li brary w ere69 1%and76 6%respecti v ely(P<0 05).Con clusi ons Pr i m ers27F/533R w as mo re e ffecti ve t han27F/519R i n ana l yz i ng the d i versity o fm icrobia l communities o f st oo l samp l es.K ey words 16S rDNA;P r i m e rs;Stoo;l Community d i versity基金项目:科技部卫生行业科研专项(项目编号:200802016)作者单位:102206 北京,中国疾病预防与控制中心传染病预防与控制所第一作者简介:李娟(1977-),女,博士,助理研究员,主要从事肠道病原菌快速检测工作通讯作者:徐建国,Em ai:l xu ji anguo@ 近年来,对不同种属16s r DNA序列的大量测定及数据库的建立,为16S r DNA序列分析方法在细菌鉴定中的应用提供了可能。

甘露寡糖对犊牛粪便菌群影响的研究

甘露寡糖对犊牛粪便菌群影响的研究赵晓静;李建国;李秋凤;孙涛;刘瑞娜【期刊名称】《中国畜牧杂志》【年(卷),期】2007(43)5【摘要】选用7日龄左右荷斯坦犊牛15头,分为3组,每组5头.其中一组为对照组,不添加任何添加剂;试验组分别添加0.1%和0.2%水平的葡萄糖甘露寡糖(Bio-Mos),各组采食营养水平相当,采食相同的牛乳、精料补充料和粗料,自由采食,自由饮水,饲喂时间30 d.观测甘露寡糖不同添加水平对犊牛粪便菌群变化和健康状况的影响.结果表明:0.1%添加水平组腹泻率低于对照组和0.2%添加组;在整个试验期,各组粪便大肠杆菌和乳酸杆菌分别呈降低和增加趋势,但差异不显著(P＞0.05),0.1%添加水平在降低大肠杆菌和增加乳酸杆菌数量指标方面均优于不添加和添加0.2%.【总页数】4页(P31-34)【作者】赵晓静;李建国;李秋凤;孙涛;刘瑞娜【作者单位】保定职业技术学院畜牧兽医系,河北保定,071051;河北农业大学动物科技学院,河北保定,071001;河北农业大学动物科技学院,河北保定,071001;中国农业大学动物营养国家重点实验室,北京,100094;北京奥特奇生物制品有限公司,北京,101407【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.饲粮中添加果寡糖对初产母猪生产性能,血清指标及粪便 pH、微生物菌群数量和挥发性脂肪酸含量的影响 [J], 李梦云;朱宽佑;刘延贺;张晓根;胡迎利2.果聚糖和甘露寡糖对水貂肠道菌群影响的研究 [J], 杜英男;鞠贵春;薛军;孙保平3.壳寡糖对生长猪生长性能、养分消化率和粪便菌群的影响 [J], 敖翔;周建川;张立泰;李元凤;何健4.甘露寡糖添加方式对哺乳期犊牛生长性能、粪便菌群及血清免疫指标的影响 [J], 金亚东;张力莉;陈绍淑;徐晓锋5.饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、血清免疫指标、转录组及肠道菌群的影响 [J], 王红明;丁雪婧;陈俭;宋守钢;谭北平;章双因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于16S核糖体DNA基因测序技术探讨分消走泄法对支气管哮喘大鼠肠道菌群的影响

基于16S核糖体DNA基因测序技术探讨分消走泄法对支气管哮喘大鼠肠道菌群的影响刘璐佳;杨阳;景伟超;王有鹏【期刊名称】《环球中医药》【年(卷),期】2024(17)2【摘要】目的采用16S核糖体DNA(16S ribo-somal DNA,16S rDNA)基因测序技术,研究白果温胆汤对支气管哮喘大鼠肠道菌群结构的影响。

方法将72只SPF 级雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、地塞米松组及白果温胆汤高、中、低剂量组,每组12只。

以卵清蛋白致敏并激发制备哮喘大鼠模型。

实验过程中观察记录各组大鼠的精神状态、食量、饮水量、呼吸及毛发光泽等情况的变化;观察各组大鼠肺组织HE染色病理改变结果;采用16S rDNA Miseq高通量测序观察肠道菌群情况,通过OTU聚类分析方法、Alpha多样性分析方法、Beta多样性分析方法分析肠道菌群多样性,通过SPSS 25.0分析比较不同干预方法下大鼠肠道菌群结构的差异。

结果 (1)行为学观察结果:白果温胆汤高、中、低剂量组及地塞米松组大鼠精神状态、饮食饮水量、毛发、呼吸均有不同程度的改善。

(2)模型组大鼠肺气管上皮破损,肺间隔增厚,炎性细胞增多。

各治疗组与模型组比较,均有一定改善。

(3)造模后,与空白组比较,模型组大鼠肠道菌群丰度Chao1指数及Observed_species指数、Faith’s PD指数、Pielou_e指数、Shannon指数均有下降趋势;地塞米松组大鼠肠道菌群各指数均有明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

与地塞米松组比较,白果温胆汤低、中剂量组Pielou_e指数、Shannon指数均有明显上升,差异均具有统计学意义(P<0.05),白果温胆高剂量组Chao1指数、Observed_species指数、Faith’s PD指数、Shannon指数均有明显上升,差异均具有统计学意义(P<0.05);与白果温胆低剂量比较,白果温胆汤高剂量组Faith’s PD指数有明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。

基于16S rDNA高通量测序技术的重度低龄儿童龋患者口腔微生物及肠道菌群群落分析

基于16S rDNA高通量测序技术的重度低龄儿童龋患者口腔微生物及肠道菌群群落分析李杨;赵梦珺;卢红巧;刘建国;刘云坤;吴家媛【期刊名称】《上海口腔医学》【年(卷),期】2024(33)2【摘要】目的:应用16S rDNA高通量测序,分析高龋及无龋儿童口腔和肠道微生物群落构成特征。

方法:从本团队前期流行病学调查的431名遵义市3~5岁儿童中,随机抽取高龋和无龋儿童各25名,采集其唾液及粪便样本。

采用16S rDNA测序技术分析样本菌群结构,比较口腔和肠道微生物菌群的构成差异。

采用SPSS 18.0软件包对结果进行统计学分析。

结果:高龋组儿童肠道菌群多样性显著高于无龋组(P<0.05)。

高龋组儿童唾液菌群多样性较无龋组高,但差异无统计学意义(P>0.05)。

在门水平上,高龋组和无龋组儿童的肠道及口腔菌群物种差异无显著性。

在属水平上,无龋组肠道中的Blautia、[Eubacterium]hallii group、[Eubacterium]eligens group显著高于高龋组(P<0.05),Parasutterella、Christensenellaceae R-7 group显著低于高龋组(P<0.05);无龋组唾液中的Peptostreptococcus显著高于高龋组(P<0.05);无龋组唾液中的Dialister、Kingella、Escherichia-Shigella、Treponema显著低于高龋组(P<0.05)。

结论:高龋儿童肠道菌群中物种多样性高于无龋儿童。

高龋儿童和无龋儿童的口腔和肠道微生物组成在属水平上存在显著差异性菌种。

【总页数】6页(P164-169)【作者】李杨;赵梦珺;卢红巧;刘建国;刘云坤;吴家媛【作者单位】遵义医科大学附属口腔医院;贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室;无锡口腔医院;口腔疾病研究国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R788.1【相关文献】1.基于16S rDNA高通量测序分析2型糖尿病腹泻患者肠道菌群的变化2.基于16S rDNA高通量测序分析老年睡眠障碍患者肠道菌群特征3.基于16S rDNA高通量测序技术分析不同身体质量指数儿童的肠道菌群结构差异4.基于16S rDNA 测序对中重度牙周炎伴脑梗死患者龈下菌斑微生物群落结构分析5.基于16S rDNA高通量测序技术分析限制基础饲粮补饲水培大麦苗对籽鹅肠道菌群的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

甘露寡糖(mos)对犊牛腹泻及生长性能的影响

甘露寡糖（mos）对犊牛腹泻及生长性能的影响试验选用36头5日龄荷斯坦杂交犊牛，在日粮中添加甘露寡糖(mos)，考察其对生长性能及腹泻率的影响。

试验分两个处理组即对照组和mos组，各l8头，mos组mos添加量为4g/头.天。

试验测定日增重(adg)，干物质(分米)、总可消化养分(tdn)以及粗蛋白(cp)的采食量及饲料转化效率，粪便评分，粪中大肠杆菌数和饲料报酬。

结果显示：相比对照组，添加mos后，日增重、采食量以及饲料转化效率均显著提高(plt;0.0l);通过粪便评分和粪中大肠杆菌数综合评定的腹泻率显著降低，饲料报酬也显著降低(plt;0.0l)。

结果表明：在犊牛日粮中添加mos能够减少犊牛腹泻，改善生长性能，降低饲料报酬。

甘露寡糖(mos)的作用犊牛出生后的2~3个月，其健康状况以及生长速度影响整个生长阶段的经济效益。

由于犊牛早期营养非常关键，许多饲料添加剂应用到犊牛日粮中以获得理想的效果，而益生元一直是研究的热点。

益生元作为一种不可被消化的食品成分，通过选择性的刺激一种或少数种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响，从而改善寄主健康。

益生元不被消化道前段消化和吸收，能够选择性地刺激有益菌群的生长(roberfroid等，l998)。

寡糖属于益生元，常见的是甘露寡糖(mos)和果寡糖(fos)，这些营养物质可以添加到犊牛代乳料和开食料中加以利用。

酵母经过水解、分离以及喷雾干燥生产工艺可获得mos。

酵母细胞表层的甘露聚糖是整个酵母或酵母细胞壁的主要抗原物质。

mos能够结合在某些菌属表面的甘聚糖结合蛋白上，通过干扰肠上皮细胞表面上的碳水化合物受体，阻止有害菌的定植，从而优化肠道中的微生物菌群。

本试验主要研究在犊牛日粮中添加mos，研究其对生长性能及饲料报酬的影响。

材料与方法试验设计试验选用36头5日龄荷斯坦杂交犊牛，随机分为2个处理组即对照组和mos组，试验持续饲喂至2月龄。

犊牛出生后即断奶，mos组犊牛每天额外饲喂4g。