基于16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响

基于16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤

胃菌群结构的影响

郭婷婷;胡丹丹;付子琳;李娜;徐晓锋

【摘要】本试验旨在利用16S rDNA高通量测序分析技术研究甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构的影响.选择泌乳阶段相近、胎次相同的泌乳早期奶牛4头,随机分为2组,对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂基础饲粮,同时添加60 g/头甘露寡糖,通过口腔灌注添加.采用2×2交叉试验设计,每期21 d,预试期14 d,采样期7 d.结果表明:1)与对照组相比,添加甘露寡糖极显著提高了瘤胃液乙酸的浓度(P<0.01),乙酸/丙酸提高了8.47％(P>0.05).2)与对照组相比,门水平上,试验组蓝藻门相对丰度极显著降低(P<0.01),装甲菌门的相对丰度极显著提高(P<0.01);属水平上,试验组厌氧螺菌属的相对丰度显著提高(P<0.05),梭菌属的相对丰度显著降低(P<0.05),锥形杆菌属的相对丰度极显著降低(P<0.01),瘤胃球菌属、假丁酸弧菌属以及毛螺菌属的相对丰度分别增加24.34％、12.83％、31.80％(P>0.05),普雷沃氏菌属的相对丰度降低4.66％(P>0.05),未注释韦荣氏菌属的相对丰度提高143.11％(P>0.05),脱硫弧菌属的相对丰度提高4.88％(P>0.05).在本试验条件下,添加甘露寡糖降低了瘤胃细菌的多样性,对纤维素降解菌群、半纤维素降解菌群影响明显,显著提高了瘤胃液乙酸浓度,提高了瘤胃液pH,但差异不显著.

【期刊名称】《动物营养学报》

【年(卷),期】2018(030)010

【总页数】11页(P4048-4058)

【关键词】奶牛;瘤胃;甘露寡糖;16SrDNA;菌群

【作者】郭婷婷;胡丹丹;付子琳;李娜;徐晓锋

【作者单位】宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川 750021;宁夏大学农学院,银川750021

【正文语种】中文

【中图分类】S816

功能性寡糖具有调控动物胃肠道微生物生长和改变微生物区系组成的作用，甘露寡糖是功能性寡糖的一种。研究发现甘露寡糖能够改善单胃动物肠道菌群结构，促进有益菌群增殖[1-2]，增强免疫力[3]，提高动物生产性能[4]。在犊牛饲粮中添加的甘露寡糖在通过小肠时，与侵入病原菌的碳水化合物基团结合，使病原菌既不能繁殖，又不能附着在犊牛的肠壁，被安全排出体外，而对乳酸菌等有益菌没有负面影响[5]。近几年研究人员在成年反刍动物上也进行了甘露寡糖应用研究，发现其在

促进瘤胃发酵、瘤胃菌群结构等方面也具有积极作用。Heinrichs等[6]报道，甘露寡糖能够优化牛的胃肠道微生态环境，促进双歧杆菌等有益菌的增殖，抑制大肠杆菌等致病菌的增殖。刘立恒等[7]研究报道，饲粮添加甘露寡糖与其他寡糖组合后，牛瘤胃液细菌的PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)图谱条带数明显增加，经测序，其中2个是产琥珀酸丝状杆菌属。甘露寡糖作为主要功能性寡糖在单胃动物

上研究较多，目前在反刍动物上的应用研究也备受关注，但甘露寡糖如何改变瘤胃菌群结构目前报道不一。为此，本研究基于16S rDNA高通量测序分析技术，探

讨添加甘露寡糖对奶牛瘤胃菌群结构与多样性的影响，为其在奶牛中的应用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘露寡糖购买于河南三化生物科技公司，纯度为99%。

1.2 试验动物与饲粮

选择4头泌乳天数为20 d、日产奶量30 kg左右、体重为550 kg左右的经产(二胎)中国荷斯坦泌乳奶牛作为试验动物。根据NRC(2001)奶牛饲养标准配制饲粮，精粗比为40∶60(DM基础)，基础饲粮组成及营养水平见表1。试验动物采用全混合日粮(TMR)饲喂方式，日投料3次，自由采食。全天自由饮水。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %项目 Items含量 Content原料Ingredients苜蓿干草 Alfalfa licorice21.53羊草 Leymus chinensis3.14玉米青贮 Corn silage27.65玉米 Corn24.47豆粕 Soybean meal14.68麦麸 Wheat bran1.48全棉籽 Whole cottonseed4.20预混料 Premix1)0.91磷酸氢钙CaHPO4 0.91食盐 NaCl 0.80氧化镁 MgCl20.23合计 Total100.00营养水平Nutrient levels2)粗蛋白质 CP 17.35产奶净能 NEL/(MJ/kg)7.23中性洗涤纤维NDF 31.25酸性洗涤纤维 ADF22.63钙 Ca 0.84磷 P0.40

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 14 000 IU，VD3 7 500 IU，VE 43 mg，Se 0.6 mg，Cu 30 mg，Fe 358 mg，Mn 260 mg，盐霉素钠 salinomycin sodium salt 20 mg，杆菌肽锌zinc bacitracin 100 mg，硫酸杆菌 sulfuric acid bacillus 39 mg。

2)产奶净能为计算值[8]，其他为实测值。NEL was a calculated value[8], while the others were measured values.

1.3 试验设计

将试验牛随机分为2组，对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂基础饲粮，同时添加

60 g/头甘露寡糖(参照刘立恒等[7])，通过口腔灌注添加。采用2×2交叉试验设计，每期21 d，其中预试期14 d，采样期7 d。

1.4 样品采集与处理

1.4.1 瘤胃液采集

通过牛口腔导管采集瘤胃液，准备牛鼻夹把牛头固定，在口腔中放入硬管(硬塑胶，内径要超过取样软管)，插入深度不要超过咽部，外面露出20 cm左右，工作人员能够用手把其固定，然后把软管(2.5 m左右)通过口腔硬管内径逐步送入瘤胃，将牛头压低，通过牛的咀嚼过程使瘤胃液自然流出。

1.4.2 瘤胃液的处理

将采集的瘤胃液转移至实验室内，用4层纱布过滤，将过滤后的瘤胃液等量混匀。pH直接用比色计测定；取20 mL瘤胃液于50 mL离心管中，然后将部分转移至

含有3 mL 25%偏磷酸和0.6% 2-乙基丁酸的10 mL离心管，于-20 °C的冰箱内

保存，用于挥发性脂肪酸浓度的测定。挥发性脂肪酸浓度采用气相色谱法

[9](Agilent-6890N气相色谱仪)测定；另取50 mL瘤胃液于离心管中，放置于-

80 ℃冰箱冻存，用于菌群结构分析，共有8个样品，其中添加甘露寡糖的试验组

4个样品(MT-1、MT-2、MT-3、MT-4)，没有添加甘露寡糖的对照组4个样品(CK-1、CK-2、CK-3、CK-4)。

1.5 DNA样品提取、扩增

1.5.1 DNA提取

DNA采用试剂盒提取，试剂盒采购于南京建成生物工程研究所，提取步骤参照试

剂盒中的说明书操作。

1.5.2 PCR扩增

PCR扩增前用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的纯度和浓度，于离心管中取适量的样品进行稀释。将稀释后的基因组DNA作为模板。瘤胃液DNA扩增目的片段为