双向凝胶电泳
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳中的问题及其解决方法
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种在两个方向上进行电泳分离的技术，通常用于核酸和蛋白质的分析。
在进行这种电泳过程中，可能会遇到一些问题。
以下是一些常见问题及其可能的解决方法：
1.电泳带模糊或不清晰：
-可能原因：
-样品质量不纯。
-缓冲液配制有问题。
-电场均匀性差。
-解决方法：
-使用纯净的、高质量的核酸或蛋白质样品。
-重新配置新鲜的缓冲液。
-检查电场均匀性，确保电场平均分布。
2.电泳速度过快或过慢：
-可能原因：
-电流设置不当。
-缓冲液浓度不正确。
-解决方法：
-调整电流，确保在设备规定的范围内。
-检查并重新配置适当浓度的缓冲液。
3.电泳带变形或扭曲：
-可能原因：
-样品加载不均匀。
-凝胶浓度选择不当。
-解决方法：
-确保样品加载均匀，使用适当的体积和加载方法。
-重新制备适当浓度的凝胶。
4.电泳凝胶干燥或开裂：
-可能原因：
-凝胶聚合物浓度太高。
-电泳室湿度不足。
-解决方法：
-降低凝胶聚合物的浓度。
-提高电泳室的湿度，可以考虑使用湿度控制设备。
5.样品负载量过多或过少：
-可能原因：
-样品量测量错误。
-样品浓度过低。
-解决方法：
-确保准确测量样品量。
-调整样品的浓度，确保在电泳中可以产生明显的带。
在实验过程中，及时记录实验条件和参数，有助于更容易地识别和解决问题。
如果问题持续存在，建议向实验室同事、导师或相关领域的专家寻求帮助。
双向凝胶电泳实验方法
双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。
NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。
2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。
3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。
4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。
2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。
双向凝胶电泳原理(一)
双向凝胶电泳原理(一)双向凝胶电泳什么是双向凝胶电泳双向凝胶电泳，英文名字为Bisulfite-Sequencing PCR，缩写为BSP，是一种检测DNA甲基化的方法。
双向凝胶电泳主要是将DNA进行酶切、连接、甲基化等处理，然后采用PCR扩增方法得到一组产物，经过电泳反应，通过测量DNA片段长度的差异和带的强度来检测DNA的甲基化状态。
双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳的原理是利用亲核性亚硫酸酯对甲基化的DNA进行转化，通过反应后将DNA分成两条互补链，在两条链上分别添加标记，如磷酸酯和辣根过氧化物酶等。
其中，磷酸酯标记的DNA是单链的，而辣根过氧化物酶标记的DNA是双链的，可以通过电泳移动。
在电泳过程中，根据DNA带的大小和强度，判断DNA片段的长度和甲基化状态。
双向凝胶电泳的步骤双向凝胶电泳需要进行以下五个步骤：1.DNA甲基化转化：将DNA处理为亲核性亚硫酸酯，反应生成甲磺酰脲基化的DNA片段。
2.PCR扩增：将转化后的DNA进行PCR扩增，得到一组产物。
3.芯片制备：将PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后将DNA嵌入在聚合物芯片上。
4.双向标记：在两个DNA链上分别添加辣根过氧化物酶和磷酸酯等标记。
5.双向凝胶电泳：将DNA芯片通过电泳反应，根据DNA带的大小和强度，判断甲基化的DNA状态。
双向凝胶电泳的应用双向凝胶电泳主要应用于检测DNA甲基化状态、遗传疾病、肿瘤等方面。
在癌症研究中，双向凝胶电泳可以检测癌细胞的DNA甲基化状态，有助于癌症的早期诊断、治疗以及预测复发等方面。
此外，双向凝胶电泳还可以应用于基因组学、生物研究、医学科研等方面。
总结双向凝胶电泳是一种检测DNA甲基化状态的方法，通过亲核性亚硫酸酯对DNA进行转化，采用PCR扩增方法得到产物，再通过电泳反应来判断DNA片段的长度和甲基化状态。
双向凝胶电泳在生物研究、医学科研和癌症研究方面的应用非常广泛，未来也将是一个热门的研究方向。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术，用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。
首先，将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。
凝胶是一种聚合物网状结构，可以限制分子的运动，将其分离。
常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
第一步是水平电泳。
在水平电泳阶段，一个方向的电场施加在凝胶中，使得带电分子向着相应的电极方向移动。
这个方向通常被称为水平方向，因为它从一个电极移动到另一个电极。
在水平电泳过程中，由于分子的大小和电荷不同，它们将以不同的速度在凝胶中运动。
大分子移动缓慢，小分子移动快速。
这样，分子根据大小按照一定的顺序移动，导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。
这个方向通常被称为水平电泳通道。
第二步是垂直电泳。
在水平电泳结束后，垂直电场被施加在凝胶中，使分子以另一个方向移动。
这个方向通常被称为垂直电泳通道。
在垂直电泳过程中，分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上（正电流）或向下（负电流）。
正电流将使分子向上移动，而负电流将使分子向下移动。
这样，分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。
最终，两个方向的电泳都完成后，在凝胶上会形成一个类似网格的结构，其中分子被分离成不同的带状。
这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来，从而确定分离出的分子的位置。
总结起来，双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。
通过水平电泳和垂直电泳，分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状，从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
二、关键参数分辨率和可重复性。
目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。
采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。
建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。
灵敏度。
双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。
双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。
三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。
双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。
双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。
成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。
通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（PDQUEST等）进行图谱差异分析，找到差别点。
然后把差别点切出，进行脱色、酶解。
最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。
通过搜库可得到差别点蛋白质的详细信息。
原理：
1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件对电泳图象进行分析。
样品要求：
1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS/40mMTris（Base）/65mM DTT；
2、样品浓度大于2ug/ul；
由于蛋白质组学涉及的样品范围很广，对于具体样品的要求请和项目经理联系。
仪器：
1st dimension:第一项
IEF:IPG-PhorII(GE)and Protean IEF(BioRad) Bio-Rad Model111Mini IEF Cell
2nd dimension:第二项
GE Ruby SE600(16x16cm)
GE Ettan DALTsix(26x20cm)
BioRad Criterion pre-cast(13x9cm)
BioRad Protean(8.6x7cm)
2D凝胶图像识别软件
Image master2D Elite®
实例分析。
双向凝胶电泳的原理
双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，其原理基于电泳的原理和凝胶电泳的原理。
电泳原理：电泳是利用物质在电场中的带电性质而产生的运动现象。
在电场中，带电的分子或离子会受到电场力的作用而向相对带电性质相反的极移动。
电泳实验中，通常使用平行的电极极板，形成一个电场，分子或离子会在电场中进行迁移和分离。
凝胶电泳原理：凝胶电泳是在分离过程中使用凝胶作为介质，使得被分离物质在凝胶中进行迁移和分离。
凝胶是具有三维网状结构的聚合物或芯粒，可以提供一定的分子筛效应，使得分子按照大小逐渐沉积。
分子越大，迁移速度越慢，分离效果越好。
双向凝胶电泳原理：双向凝胶电泳是在凝胶电泳的基础上，通过在电泳过程中改变电场方向，实现不同方向上的分离。
通常情况下，第一维电泳是水平电场电泳，第二维电泳是垂直电场电泳。
具体步骤如下：1. 首先，将样品加入到凝胶电泳样品槽内，通常是在蛋白质样品中加入还原剂和样品缓冲液，使其在电泳过程中具有一定的带电性质。
2. 准备两个平行的平板凝胶，其中一个用于第一维电泳，另一个用于第二维电泳。
凝胶通常是聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖双层凝胶。
第一维电泳凝胶的方向通常是水平的，第二维电泳凝胶的方向通常时垂直的。
3. 将第一维电泳凝胶浸泡在浸泡液中，然后将电泳样品加入到凝胶中定位。
开启电源，施加电场使样品在凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。
可以根据需要调整电场的强度和时间。
4. 当第一维电泳结束后，将凝胶取出并固定，然后将其放入第二维电泳凝胶中。
将电泳样品加入到第一维凝胶的上方定位。
5. 开启电源，施加电场使样品在第二维凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。
6. 最终，根据分子的大小和电荷，样品中的蛋白质会在凝胶中形成一系列分离带，可以通过染色等方法观察和分析分离结果。
通过双向凝胶电泳，可以实现对复杂混合物中的蛋白质的分离和分析，便于进一步的研究和应用。
双向凝胶电泳缺陷胶及其原因
双向凝胶电泳缺陷胶及其原因双向凝胶电泳是常用的分离和检测DNA分子的方法之一。
在这种电泳中，DNA样品在两种不同的凝胶中移动，以实现更高的分辨率和精度。
然而，双向凝胶电泳中有时会出现缺陷胶的现象，这会导致分离和检测结果的错误和不可靠性。
本文将探讨双向凝胶电泳缺陷胶的原因及解决方法。
双向凝胶电泳简介双向凝胶电泳通常使用两个跑道进行分离，从而获得更高分辨率的DNA带。
第一个泳道使用富含琼脂的缓冲液进行分离，而第二个泳道使用聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
这种双向分离的过程可以消除非特异性带和不受限制的DNA扩增产物。
在双向凝胶电泳过程中，常常会出现缺陷胶的问题，这可能是由各种因素引起的。
以下是一些可能导致缺陷胶的原因。
原因一：琼脂注入时需要慢慢滴入在凝胶制备过程中，琼脂通常需要按比例加入缓冲液中并充分溶解。
然而，大量的琼脂过快地加入到溶液中，可能导致不均匀的凝胶达到缺陷胶的结果。
因此，在制备琼脂凝胶时需要细心慢慢添加琼脂。
原因二：凝胶中存在气泡凝胶中存在气泡也是导致双向凝胶电泳缺陷胶的原因之一。
当凝胶中存在气泡，会在电泳过程中产生电场差异，从而导致DNA分离不均匀。
因此，在凝胶制备过程中需要尽可能避免气泡的产生。
原因三：电场分布不均匀电场也是影响双向凝胶电泳的一个重要因素。
如果电场分布不均匀，将导致样品在凝胶上移动的不均匀。
因此，在进行电泳过程中需要确保电场分布均匀。
原因四：凝胶制备温度不稳定凝胶制备过程的温度也会影响电泳分离的结果。
如果温度不稳定，可能会导致凝胶中的缺陷和不均匀。
为了最大程度地避免这种情况发生，精确地控制凝胶的制备温度是非常重要的。
解决方法为了避免双向凝胶电泳中出现缺陷胶，可以采取以下措施：1.凝胶制备过程中注意细心，慢慢添加琼脂，并避免气泡产生。
2.确保电场分布均匀，可以通过合适的电场调节和减少跑道的长度和宽度来实现。
3.准确地控制凝胶制备温度，避免温度变化过大。
另外，排除缺陷胶的其他原因也是很重要的，这包括检查标记物或样品浓度是否正确、注射样品时是否加入了过多的物质、电泳时间是否恰当等等。
质谱鉴定双向电泳蛋白
百泰派克生物科技质谱鉴定双向电泳蛋白双向电泳即双向凝胶电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，以实现更精确的鉴定。
百泰派克生物科技提供双向电泳获得的兴趣蛋白的质谱鉴定服务。
双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis），也称作双向凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis）或二维凝胶电泳，缩写为2-DE或2-D电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
双向电泳是等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和SDS-PAGE的结合。
蛋白质混合物在二维凝胶上，首先根据pH值对蛋白质进行等电聚集电泳分离，之后根据蛋白质分子大小进行SDS-PAGE分离。
双向电泳完成后，将凝胶进行染色即可得到一个蛋白质二维分布图。
常用的染色技术有考马斯亮蓝染色、银染、负染和荧光染色。
双向电泳中，通过在电泳时在一条泳道上添加已知相对分子质量的一系列标准蛋白质，可以对样品中的蛋白质的相对分子质量进行估算。
质谱鉴定双向电泳蛋白通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，从而实现目标蛋白的精确鉴定。
对于Coomassie Blue，SYPRO Ruby以及Silver stain染色的样品，均可通过质谱进行蛋白的鉴定。
但是，银染的样品有可能会与质谱分析不兼容，推荐使用以下产品或者实验步骤进行银染实验：ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)；Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)。
此外，用于质谱鉴定的银染样品不要进行脱色处理。
蛋白质组学研究中的核心技术—双向凝胶电泳
(4)c. 图像分析及数据处理(3)经活检及病理证实，有 12 条为扩张型心肌病特有的蛋白。
(6)RA 和 OA ：类风湿关节炎 (RA) 是一种常见的慢性炎性关节疾病，本病侵犯多个关节，主要累及手足小关节，病情迁延反复，主要的病理变化为关节滑膜的慢性炎症，细胞侵润，血管翳形成，软骨及骨组织侵蚀，导致关节结构的破坏，功能丧失。
而骨性关节炎 (OA) 其基本病理改变为多种致病因素引起的进行性关节软骨变性，破坏及丧失，关节软骨及软骨下骨边缘骨赘形成，由此引起一系列的关节症状和体征。
有研究者对滑膜细胞进行原代培养，应用流式细胞仪鉴定滑膜细胞类型，提取蛋白进行双向电泳分离，比较 RA 与 OA 成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-Like Syno-viocytes ， FLS) 蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异，结果显示： RAFLS 蛋白酪氨酸磷酸化较 OAFLS 明显增多，其中以相对分子质量 42 × 10 3 ~95 × 10 3 间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多，对其结果进行灰度扫描， RAFLS 灰度扫描值为 4227672 ± 8947 ，OAFLS 为 663480 ± 7962 ， RAFLS 的灰度扫描值约为 OAFLS 的 6.5倍，两者具有非常显著性差异 (T= 2.820 ， P<0.01) 。
1980 年 Hunter 首先发现酪氨酸激酶 (PTK) ，许多生长因子受体都具有 PTK 活性，一半以上的癌基因产物也具有 PTK 活性，他发现酪氨酸磷酸化比例虽小，但却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键，癌基因活化后， PTK 活性大大增加。
1992 年，Williams 等研究发现， RA 滑膜细胞中的 PTK 活性远远高于 OA ，这可能是导致 RA 滑膜细胞转化特性而呈持续活化状态的关键，作者推测RAFLS 可能存在原癌基因的活化或突变，或多种生长因子受体的持续激活，从而导致转化细胞的外观表现并伴有 PTK 活性的增高。
第八课双向凝胶电泳
二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。 • 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶， 因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓 缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙 烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
2D Gel-Based Proteomics
聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质的检测
• • • • • • • 理想显色剂的7S 安全（safety）： 灵敏（sensitivity）： 简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）：
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
• 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 （如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证 待研究蛋白的可检测性。
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离：尽管增加上样 量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时 的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰 度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应 而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的 微制备技术进行分离：即将总蛋白组分 成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个 pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品
细胞
样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分 级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
样品的溶解
第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
转印至膜上的蛋白
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质或核酸分析技术，其特点如下：
1. 高分辨率：双向凝胶电泳可以提供较高的分辨率，允许分离几乎相同大小的DNA片段或蛋白质，使其成为分析样品组成和结构的有力工具。
2. 分离适应性强：双向凝胶电泳适用于各种样品类型，包括DNA、RNA和蛋白质等，可以进行定性和定量分析。
3. 定量准确性：通过比较样品与标准曲线，双向凝胶电泳可以精确地确定样品中的目标物含量。
4. 可视化：双向凝胶电泳结果可以直接观察，并且可以使用染色剂或放射性示踪剂对目标蛋白质或核酸进行可视化。
5. 提供局部结构信息：双向凝胶电泳可以提供有关分子的局部结构信息，如转录起始位点、剪接位点等。
6. 适用于高通量分析：双向凝胶电泳可以同时分析多个样品，适用于高通量分析，提高分析效率。
总的来说，双向凝胶电泳具有高分辨率、适用于多种样品、准确度高、可视化、提供局部结构信息和高通量分析等特点，是一种常用的分析技术。
《双向凝胶电泳 》课件
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
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双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。
有文献报道,N末端4个残基序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。
如再结合C末端序列,判断结果的准确性会更高。
对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白,电泳时蛋白质已经过了高度纯化。
现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品,因此每个分离的蛋白斑点可有μg数量的蛋白,这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。
蛋白质的翻译后修饰和加工,是指在肽链合成完成后进行的化学反应,如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成,以及最近发现的蛋白质自剪接等等,可能有一百种以上。
翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的,它们的变化往往和疾病的发生有关。
用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究,如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。
双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象,很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。
拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是:(1)低拷贝蛋白的鉴定。
人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。
除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外,最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上,但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。
(3)极大(>200kD)或极小(<10kD=蛋白的分离。
(4)难溶蛋白的检测,这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。
(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术,因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。
双向电泳操作方法1 蛋白质样品制备秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行。
100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM 即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1 小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5 M尿素,5mM 碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100], 37℃育30min,期间搅动几次,28度(温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min 离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。
或者-70度保存2 蛋白质浓度测定按Garrels(1983)的程序,稍加改动。
10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸,冰浴30min后,4℃,4000 r/min离心15min,弃上清,再加入100μl冷丙酮,同上离心5min,弃上清,冻干沉淀,用100μl PBS溶液复溶,并按Bradford (1976)的程序测定蛋白质浓度。
2.3.1 电聚焦(IEF)2.3.1.1 玻管准备干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部,在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。
电聚焦的管子,买原装的也可以,实在不行自己也可以做的,1ml 的移液管,内径1.5mm 左右的,长度取18cm,用玻璃刀做,玻璃管的处理,先用2M 的NaOH 泡至少1hr,用自来水冲后;用双蒸水冲,用双蒸水泡至少1hr,中间至少换2,3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时,用双蒸水冲,(不能用自来水冲),然后双蒸水泡至少1 个小时,中间换3, 4 次水,可多泡一会。
最后泡在无水乙醇里面1hr,烘干就可以用了.2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦灌IEF的配方为3.09克尿素1.125 ml 10%NP-401.125ml 水0.735ml 30%丙烯酰胺(ACR 28.38 BIS 1.62)0.15 ml Am 3.5-100.375ml Am 5-78微升10%AP1.8微升TEMED用注射器吸好胶液,装上7号针头,将7号针头插入玻管底部,边推注射器边提针头,直到标记处,用微量进样器小心加入少量水,可见明显的界面出现,让其聚合1小时以上,适当长一点的时间更好。
待胶聚合好后,除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液,加样80μg,上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH 的界面。
即可进行电泳。
电极液为:上槽(负极)为50m mol/L NaOH 液,下槽(正极)为25m mol/L H3PO4。
按200V×15min,300V×30min,400V×18h,1000V×1h的程序进行电聚焦。
或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定不好.2.3.1.3 电泳后的凝条处理电聚焦完毕后,用注射器吸满水,套上一个200μl的枪头,当然枪头与注射器间用parafilm 封住防漏气。
从顶部向下注水使胶条向下滑出注射器枪头玻璃管必须为一直线。
取一胶条,用双蒸水洗净两端,按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段,各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜,次日用酸度计分别测定各段的pH值,以凝胶长度为横坐标, pH值为纵坐标作图,即为等电点标准曲线。
漫漫挤,管子,200 卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200 卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来, 注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿。
对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS,62.5m mol/L Tris-HCL (pH6.8),10%甘油,5%β-巯基乙醇,0.1%溴酚蓝]进行二次平衡,第一次20min,第二次25min。
第2 次的溶液为新的。
平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。
2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶浓度为12%,无浓缩胶。
待胶聚合后,将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端(避免胶条拉直),并用1%琼脂糖(电极缓冲液配制)封胶,特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。
61厂板子之灌胶:坚决不用凡士林,用透明胶将两端(板子的2 边)封住,再用2%琼脂之SDS-PAGE 电极液封底,待琼脂凝固后再灌胶,最后用水封胶。
1,灌胶不会有任何问题,不能漏,2,不用浓缩胶,只用分离胶。
3,分离胶用水封,要保证凝聚好的PAGE 胶,为一平的线。
用透明胶(约4cm宽),封住两边,下面还是用2%的琼脂封。
灌好电极缓冲液[25m mol/LTris,192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS],按25mA/板胶恒流进行电泳,待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳,一般电泳耗时约4-5h。
银染:凝胶于40%甲醇,10%醋酸中固定1h以上或者过夜;用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min;水洗6×5min;0.02%硫代硫酸钠1min;水洗3×20s;0.2%硝酸银,0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银,0.02%甲醛20min;水洗3×20s;显色液(3%碳酸钠,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了;水洗20秒;0.05%甘氨酸停显。
染色理想温度:最好是20 度左右。
10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮(100ml):100%TCA 10ml2-ME 0.07ml丙酮90ml0.07%2-ME 丙酮(100ml):2-ME 0.07ml丙酮100ml0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)50mlUrea 28.5gNP-40 1mlAmpholine 5~7 2.0ml3.5~10 0.5ml2-ME 2.5ml定容,配好后用1.5ml 管分装!-70度保存UKS液(含9.5M Urea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100) 25ml 50mlUrea 14.25g 28.5gK2CO3 17.25mg 34.5mgSDS 0.3125g 0.625gDTT 0.125g 0.25g2-MEAmpholine(3.5~10) 1.25ml 2.5mlTriton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 枪,4枪)2-ME 可适当加一些!注意定容!配好后用1.5ml管分装!-70度保存!双向电泳IPG(summer)一、样品提取:三氯醋酸—丙酮沉淀法(1)在液氮中研磨叶片(2)加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm 以上1 小时)弃上清。