大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

大鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕

【摘要】目的:探讨影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的REF培养体系.方法:取SD大鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对REF的生长形态、生长曲线进行观察,以探讨不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对REF分离及培养的影响,并对其进行免疫细胞化学鉴定.结果:13.5d 胎龄鼠胚的REF分离效果优于10.5d、18.5d 胎龄鼠胚;REF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;并表达波形蛋白(vimentin)、层黏连蛋白(laminin,LN)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)蛋白.结论:13.5d 胎龄SD大鼠REF以H-DMEM做培养基,在第3代增殖旺盛,合成多种细胞外基质,最适宜作胚胎干细胞或其它悬浮培养细胞的饲养层.

【期刊名称】《神经药理学报》

【年(卷),期】2010(027)003

【总页数】4页(P17-20)

【关键词】大鼠;胚胎;成纤维细胞;层黏连蛋白;纤维连接蛋白

【作者】商爱民;吴靖芳;薛刚;张静;张耕

【作者单位】河北北方学院教务处,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000;河北北方学院基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北,张家口,075000

【正文语种】中文

【中图分类】R329.2;Q256

胚胎成纤维细胞饲养层是体外成功培养人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)

细胞的必要条件。主要分泌某些细胞因子如成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子[1],以促进 ES细胞增殖以及抑制分化。同时又能分泌细胞外基质,如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin,LN)等。胰岛细胞从它们自然的细胞外基

质中分离出来将可能经历一种奇特的凋亡死亡过程[2]。为分离的胰岛移植前提供

合适的微环境,许多学者采用小肠粘膜细胞、肝细胞、垂体前叶细胞、Sertoli细胞与胰岛共同培养均可使“目的细胞”的存活和功能情况明显改善[3-5]。本研究对

影响大鼠胚胎成纤维细胞(REF)分离和培养的一些因素和方法进行探索,旨在建立稳定的REF培养体系。

1.1 材料

1.1.1 实验动物成年SD大鼠孕鼠(12～14d)5只,由军事医学科学院动物中心提供。

1.1.2 实验试剂 H-DMEM、胰蛋白酶(Gibco公司)、胎牛血清(Hyclone公司);青

霉素、链霉素(华北制药)、台盼兰、MTT(Sigma公司);Vimentin、细胞角蛋白

18(Cytokeratin 18,CK18)单克隆抗体、FN、LN多克隆抗体、生物素标记的羊抗

鼠试剂盒、生物素标记的羊抗兔试剂盒、生物素标记的羊抗兔试剂盒(中杉公司);DAB显色试剂盒。

1.1.3 实验仪器手术器械、相差显微镜(NikonTE2000)、普通光学显微镜(Olympus BH-2)、CO2培养箱(Forma公司)、酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 原代REF的制备[6]将性成熟雌鼠(6～8周龄)与雄鼠(8周龄)按2∶1比例合笼,每天早上观察雌鼠阴道口,有乳白色或淡黄色胶冻状物(阴道栓)者即认定为怀孕

0.5d。取妊娠10.5～18.5d的孕鼠,按薛庆善[7]的方法制备上清液。重复其消化过程,直至上清澄清为止。合并各次上清,1000r/min离心5min,弃上清,以完全培养液吹吸悬浮沉淀成单细胞悬液,加入75cm2培养瓶,37℃,5%CO2培养。

1.2.2 台盼兰排斥实验检测原代REF细胞存活率

将REFs单细胞悬液细胞密度调整为106细胞/ mL。取9滴细胞悬液滴到载波片上,加1滴0.4%的台盼兰溶液,混匀。3min之内用血球计数板分别记数活细胞数和死细胞数(注:镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染)。根据公式:活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100。

1.2.3 二代REF培养原代REF生长铺满培养瓶后消化传代,消化液为0.25%胰酶,在显微镜下观察消化过程,见细胞变圆后立即以完全培养液(含10% FBS、100U/mL 青霉素和80U/mL链霉素的DMEM低糖培养液)终止消化。

1.2.4 细胞的冻存与复苏冻存液为1份二甲基亚砜(DMSO)与9份完全培养液混合,冻存与复苏按常规进行。

1.2.5 细胞生长曲线测定

①将接种前的一部分均匀REF单细胞悬液接种于96孔板,每孔加样200μL,接种9排,每排5孔,测定1排/d;②将96孔板置于37℃孵箱里培养1d;③培养终止前4h 向所测排的每孔加入MTT 20μL;④置于37℃孵箱继续培养4h;⑤4h后吸去上清,加入150μL DMSO终止;⑥将 96孔板置于酶标仪上, 490nm测定吸光度。

1.2.6 REF细胞爬片

将P0、P1、P2、P3代REF接种后留少许均匀REF单细胞悬液接种于铺有盖玻片的6孔板,每孔加样2～3mL(铺满每孔底部即可)。37℃孵箱培养1～2d。盖玻片上细胞密度适中,可以终止培养。细胞爬片用PBS清洗3次;95%的酒精固定

15min。PBS清洗3次。晾干后以中性树胶将无细胞侧贴于载玻片,待用。

1.2.7 爬片染色

固定后的爬片以蒸馏水洗涤,PBS洗3次。常规HE染色:苏木素中染色2～5min。流水清洗,1%盐酸溶液分色。1%氨水蓝化;流动自来水清洗爬片3次。0.5%伊红水溶液中1～5min。爬片进入蒸馏水中清洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明。中性树胶封片。免疫细胞化学染色按试剂盒说明书进行,苏木精复染细胞核。阴性对照略去一抗其余步骤不变。

2.1 细胞生长曲线

由图1可见第3代REF在培养至第3d时进入对数生长期,细胞快速增加,至6d时细胞数达高峰,未经明显的平台期,便进入衰退期,细胞数量下降,可见有细胞漂浮。

2.2 生长形态观察

胚胎组织经胰酶消化解聚后呈球形。REF在体外为贴壁生长型细胞,大小不均,异质性较大,原代培养约4～12 h开始贴壁,胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形或不规则异形等形状,中间有卵圆形核。原代REF细胞中有时杂细胞较多,可能混杂有上皮样等细胞(图2)。传两代后(P3)细胞才较纯,第五代(P5)以后,细胞开始老化。可见细胞伪足增多,并有分叉,细胞内颗粒增多,细胞之间空隙较大(图3、4)。

2.3 原代消化后细胞存活率台盼兰染色后计细胞总数共1 800个,其中着色细胞(死细胞)106个,未着色细胞(活细胞)1 694个,细胞存活率94.11%。

2.4 胚胎日龄胎鼠对REF的影响

10.5 d、13.5d、18.5d龄小鼠胚胎均可分离得到成纤维细胞,但10.5d鼠胚太小,不利操作,分离所得细胞数量少;18.5d鼠胚有骨细胞的混杂,分离所得成纤维细胞中杂细胞较多,且易老化;13.5d胎鼠分离所得细胞数量多,杂细胞较18.5d胎鼠少,细胞增殖能力强。

2.5 冻存对REF的影响

我们对冻存的P1和P2代细胞复苏后的培养情况观察发现P1代细胞复苏后形态要优于P2代,且复苏细胞传代后与未经冻存的细胞相似,不影响其活性和功能。