引物设计之退火温度

Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。

不同序列的DNA，Tm值不同。

DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。

退火温度（Annealing Temperature）为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度·它是影响PCR特异性的较重要因素。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和
模板发生结合。

由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会
远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。

计算方法
核酸Tm值（解链温度）计算
评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达
到的温度，
当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体
程度而增加，直至完全解体。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。

2温度时间
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长
度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点
较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异
性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模
板之间完全结合。

在金属加工领域，退火温度是指退火时金属应加热达到的温度。

据有关文献介绍，不同金属材料的退火温度为：铂，900—1000℃；铜，650℃；黄铜，600—650℃；镍银，650—680℃；铝，283—350℃等
影响Tm值的因素：
①DNA碱基组成：C-G含量越多，Tm值越高；A-T含量越多，Tm值越低。

②溶液的离子强度：在低离子强度中，Tm较低，而且解链的温度范围较宽；在高离子强度中，Tm值较高，解链的温度范围较窄。

③PH值：溶液的PH值在5~9范围内，Tm值变化不明显，当PH>11或PH<4时，Tm值变化明显。

④变性剂：各种变性剂主要是干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低Tm值。

⑤DNA双链本身的长度。