第16章 Southern杂交技术

第16章 Southern杂交技术
根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。

将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA 进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。

它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。

还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。

核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。

其基本过程包括以下几步。

首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。

最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。

根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。

前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。

本章主要介绍Southern杂交技术及其与斑点杂交技术的不同点。

而Northern杂交技术将在第17章介绍。

16.1主要内容
1. Southern Blot方法的原理。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳。

3. DNA转移至硝酸纤维素膜及膜处理。

4. 介绍随机引物法标记DNA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过程。

16.2目的要求
掌握Southern blot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。

16.3 实验原理
Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。

其原理是根据毛细管作用的原理，将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测这些被转移的DNA片段。

主要步骤包括将基因组DNA进行限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳分离，经碱变性等预处理之后，平铺在已用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上，在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜，接着加一叠干滤纸，然后再压盖一重物。

由于干滤纸的吸引作用，凝胶中的单链DNA便随电泳缓冲液一起转移。

这些DNA分子一旦与硝酸纤维素滤膜接触，便会牢牢地与之结合，而且是严格按照它们在凝胶中的谱带模式，原样地被吸印到滤膜上。

在80℃下烘烤1 2h，DNA片段就会被稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。

然后将此滤膜移放在加有标记探针的溶液中进行核酸杂交，漂洗去游离的没有杂交上的探针分子，用适当的方式显色，与溴化乙锭染色的凝胶谱带作对照比较，便可鉴定出与探针具有同源性的限制片段的大小和位置。

见图16-1。

图 16-1. Southern blot印迹杂交原理示意图
（a）核酸内切酶消化的基因组 DNA；（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段；
（c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；（d）滤膜与标记的DNA分子探针杂交；（e）显色显示杂交的DNA谱带。

Southern blot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ng DNA也能被清晰地检测出来。

16.4材料、试剂及器材
16.4.1 材料及试剂
1．待检基因组DNA样品由实验室提供。

本实验所用特异性探针可预先标记，标记方法见第6章。

琼脂糖凝胶电泳试剂，参见第7章。

DIG标记和检测试剂盒，各种限制性内切酶等。

2．20×SSC溶液：氯化钠 3mol/L，柠檬酸三钠0.3mol/L（pH7.0）。

称取NaCl 175.3g，柠檬酸三钠·2H20 88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用1mol/L HCl调pH7.0，最后定容到1000ml。

3．变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl。

4．中和液：1mol/L Tris-HCl（pH7.4），1.5mol/L NaCl。

5．洗涤液Ａ: 2×SSC，0.1%SDS。

洗涤液Ｂ：0.1×SSC，0.1%SDS。

洗涤液 C: 0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl(pH7.5），3％(v/v) Tween-20。

6．马来酸溶液(Maleic acid): 0.1mol/L 马来酸，0.15mol/L NaCl，用固体NaOH调pH7.5。

7．平衡液(Detection buffer): 0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl(pH9.5）。

8．终止液(TE buffer): 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。

9．封阻（Blocking）溶液: 用马来酸溶液将10×Blocking solution 稀释10倍。

10．抗体溶液（Antibody solution）:用Blocking溶液将Anti-Digoxigenin-AP按照1：5000比例稀释。

11．显色液（Color-substrate solution）: 平衡液中含2％NBT/BCIP储存液。

16.4.2 器材
硝酸纤维素滤膜；恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心机，
高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MM Whatman滤纸，干烤皿，玻璃平台等。

16.5方法与操作步骤
1．酶切基因组DNA 用一种或是多种限制性内切酶消化适量DNA。

当用标准长度探针（>500bp）杂交检测单拷贝基因时，基因组DNA要求在10μg。

当用寡核苷酸探针时，则需30~50μg DNA。

由于基因组DNA的粘性非常大，所以在用限制性酶切酶切割的时候应该按照以下操作，保证DNA得到均匀分散。

（1)DNA稀释并加入10×限制酶缓冲液于4℃放置数小时，并不时用毛细管温和地搅动DNA溶液。

（2)加入第一种酶后先于4℃搅动2~3min，然后再加热到相应温度。

（3)消化15~30min后再加入第二种酶，于相应温度消化完全。

2．消化DNA的电泳待消化完全后，加入上样缓冲液。

通过0.7％琼脂糖凝胶分离DNA片段，应在4℃缓慢电泳（<5V/cm），待溴酚兰走到离凝胶边缘1cm处时，停止电泳，对凝胶进行拍照。

3．DNA向膜的毛细管转移
（1）电泳完毕，将凝胶上无用部分切去，并切去左上角作为标记。

将凝胶置于数倍体积的变性液中浸泡45min，不断温和振摇，使DNA变性。

（2）小心弃去变性缓冲液，用蒸馏水稍加漂洗。

加入至少4倍体积的中和缓冲液，置室温摇床温育15min。

重复1次。

（3）安装转移装置进行DNA印迹。

当凝胶仍然处于中和液中时，用一张Whatman 3MM滤纸包裹一块玻璃板，做成一个略大于凝胶的平台，并将这个平台放于一个大干烤皿中，倒入转移缓冲液10×SSC，使液面略低于平台面，当滤纸湿透后，赶走所有气泡。

裁一张略大于凝胶的滤膜（硝酸纤维膜或尼龙膜），预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20×SSC浸泡至少5min。

切去滤膜的一角，使其与凝胶的切角相对应。

取出凝胶并将其面向下倒扣在滤纸上小心赶出凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中（虹吸短路）
将湿润的硝酸纤维素膜至于凝胶上，并在膜上放上两张与膜相同大小的用2×SSC浸湿的3MM 滤纸，小心赶出凝胶与滤纸间的气泡。

放一叠干燥的吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸上（约5~8cm高）。

置一玻璃板于吸水纸上，其上放一重约500g的重物。

DNA转移可进行12～16h（如过夜）。

当纸巾湿透时应更换新的，并且保持干燥皿中有足够的转移缓冲液。

（4）毛细管恒吸转移完毕，小心拆卸印迹装置。

将膜与凝胶一起转移至干燥的滤纸上，凝胶在上，用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置，去掉凝胶。

（5）用6×SSC漂洗滤膜5min，以去除琼脂糖残迹。

将滤膜放在一张干燥的3MM滤纸上晾干。

（6）将晾干的滤膜夹在两张3MM滤纸之间，在干烤箱中80℃干烤2h。

这时的滤膜已可用于预杂交和杂交处理，或贮存在4℃。

硝酸纤维素膜需真空保存，尼龙膜需用塑料薄膜密封。

注意：Dot blot不需要DNA进行消化、电泳、转膜等过程，而是将待检样品直接点加到预处理好的硝酸纤维素膜上，在干烤箱中80℃干烤2h固定，再进行以下步骤。

4．用DIG试剂盒进行预杂交、杂交
（1）预杂交：将适量DIG Easy Hyb加热至杂交温度 37℃~42℃。

将干烤后的硝酸纤维素膜放入一个比膜稍大的塑料袋中，按10ml /100cm2膜的比例加入适量的预杂交液，赶走气泡，封口
机封口，42℃预杂交30min。

预杂交过程应缓慢振荡。

（2）探针处理：将制备好的探针于沸水加热5min并迅速放入冰水混合物中。

然后按照一定比例加入到预热的预杂交液中，制成杂交用探针溶液。

加入过程应尽量防止气泡产生。

（3）杂交：弃掉预杂交液，将制备好的探针溶液加入塑料袋中(3.5ml/100cm2膜)。

于杂交温度(37℃ 42℃)，缓慢振荡杂交4h。

（4）洗膜：杂交完毕后，取出膜，室温下，用洗涤液A漂洗膜2次，每次5min。

洗涤过程应不断缓慢振荡。

再在65℃用洗涤液B漂洗膜2次，每次15min。

洗涤过程应不断缓慢振荡。

最后用洗涤液C洗涤膜，室温晃动2min，倒掉洗涤液。

（5）加入100ml封阻液，室温晃动30min，以除去没有特异结合的探针，倒掉封阻液。

（6）加入20ml抗体溶液，室温晃动30min，倒掉溶液。

（7）用洗涤液C室温晃动洗涤膜2次，每次15min，以除去多余的抗体，倒掉洗涤液。

（8）平衡，加入20ml平衡液，室温放置3min，倒掉平衡液。

（9）显色，加入10ml显色液，于黑暗中显色，目标条带显色后用50ml TE终止反应。

注意事项
1. 膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试剂的量可根据需要进行适当调整。

2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。

3. 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。

思考题
1．什么是印迹技术？
2．说明什么是探针？
3．简述Southern blot技术的原理及应用。