烟草遗传转化实验报告

烟草遗传转化实验报告
实验目的
烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和
一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡
实验要求:
掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介
导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡
实验原理:
根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱
导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含
有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是
毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转
化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因
删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡
p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄
糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡
实验器材
摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡
实验材料
植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0
烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA
烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA
卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡
头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡
利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。