LCMSMS检测动物源性食品中β激动剂类是否需要酶解

分析 检测

LC-MS/MS检测动物源性

食品中β-激动剂类是否需要酶解 辛堃 杨桂霞 李淑敏 葛明华 山东中质华检测试检验有限公司

实验对β-激动剂是否需要酶解进行了

实验说明，结果表明克伦特罗和沙丁胺醇不需要酶解就能被提取出，而莱克多巴胺在不酶解时提取效率低。本实验对酶解时间和酶解温度进行了优化，在40℃下酶解2h时，三种瘦肉精的回收率和精密度均能满足实验要求，提高了检验效率。

瘦肉精是一类药物的统称，用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病，大剂量用在饲料中可以促进猪的增长，减少脂肪含量，提高瘦肉率，但食用含有瘦肉精的猪肉对人体有害,在我国已经禁用。瘦肉精是一种肾上腺类受体激动剂（神经兴奋剂），即β-受体激动剂，如克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。“瘦肉精”化学性质稳定，加热到172 ℃时才分解，因此，一般烧煮加热方法不能将其破坏。如果长期食用含有瘦肉精的肉，会导致染色体畸变的可能，诱发恶性肿瘤，造成安全隐患。

β-受体激动剂大多有苯乙胺醇和叔丁基或异丙基连接而成的，一般可分为苯胺基、苯酚、淀粉三种类型，对于苯酚、淀粉苯环上那个羟基是结合的位点，β-受体激动剂在体内代谢完，会跟羟基结合，形成一个葡萄糖醛苷的代谢物，需要酶解游离出来，才能进行检测。而不同的化合物，蛋白结合率也不相同。根据苯环上取代基的差异，克伦特罗属于苯胺型结构轭合反应率和蛋白结合率低。但苯酚型的轭合代谢过程较强，如沙丁胺醇在组织和排泄物中主要以硫酸轭合物的形式存在，其次为葡萄糖醛酸轭化物；特布他林主要为硫酸轭化物；莱克多巴胺主要以葡萄糖醛酸轭化物形式存在。苯胺型结构的化合物在酸性环境下很容易由结合态转变为游离态，所以有些标准对猪尿的检测就没有酶解这一步；莱克多巴胺苯酚型β-受体激动剂轭合代谢过程较强与蛋白结合率高，所以检测时是需要酶解的。在肝脏组织中β-受体激动剂与蛋白结合率高、残留量大，实验时也需要酶解。

现行有效的β-受体激动剂类检测标准主要有GB/T 21313-2007、GB/T 22286-2008、SN/T 1924-2011和农业部1025号公告-18-2008，四种方法均采用37℃下避光酶解16 h的方式把与蛋白结合的目标化合物释放出来。考虑到实验长，是否可以不进行酶解或者缩短酶解时间来提升实验室检测效率呢？本文通过实验进行了论证，如下。

实验部分

依据检测方法在加标浓度为1ng/mL、2ng/ mL、5ng/mL时、回收率为85.0%～110.0%，相对标准偏差小于5%。标曲在浓度范围0.5～10μg/kg 时线性关系良好（2r＞ 0.995）。

主要仪器：Agilent 液相色谱 - 质谱联用仪（1260-6460）；高速动能均质仪（IKA：T25）；离心机（sigma：3-18KS）；氮吹仪（Organomation：N-EVAP 112）；恒温水浴摇床（上海博讯：HHS-21-8）；涡旋混合器（上海精科：XW-80A）；电子天平（赛多利斯：BSA224S）；pH计（赛多利斯：PB-10）。

标准品及标准曲线配制：莱克多巴胺盐酸盐；氘代莱克多巴胺（d6）；盐酸克伦特罗；克伦特罗-D9；沙丁胺醇；沙丁胺醇-D3，均使用德国Dr.Ehrenstorfer标准品。用甲醇溶解各标准品并稀释成20 ng/mL的外标混合工作液和100 ng/mL内标混合工作液。用初始流动相配制成0.5、1、2、5、10 ng/mL的标准工作曲线。

样品前处理：取三种有代表性可食部分肌肉组织阳性样品（非加标）500 g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，每个阳性样品称取3个平行样进行酶解与不酶解的比对试验，A为沙丁胺醇阳性样品，B为克伦特罗阳性样品，C为莱克多巴胺阳性样品。称样2.0 g样品于50 mL离心管中，加入50 µL 100 ng/mL内标混合工作液，40 µLβ-葡萄糖酫苷酶，再加入20 mL 2.0 mol/L乙酸铵缓冲液（乙酸调节PH为5.2），涡旋1分钟后放入37℃水浴震荡器中避光过夜酶解16小时。取出离心管放置室温，于9000转高速离心，取上清液于另一50 mL离心管中，加入20 mL乙腈饱和的正己烷脱脂，涡旋振荡10 min，于9000转高速离心，取下清液过滤纸至另一离心管中，2 mL乙酸铵缓冲液洗涤滤纸，待净化。净化过程：使用混合阳离子交换固相萃取柱（Cleanert PCX 60 mg/3 mL），依次用3 mL甲醇，3 mL水，3 mL 0.1% Hcl进行活化，加载过样,再依次加入3 mL0.1% Hcl，3 mL水，3 mL 50%甲醇水溶液进行淋洗。洗脱：将净化柱放置10 mL离心管上，加入5 mL （95:5）的甲醇-氨水，50℃下氮气吹干，用1

本

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化合物母离子子离子碎裂电压碰撞能量加速电压莱克多巴胺-D6308.1168.1110143

莱克多巴胺302164.1110123

莱克多巴胺302121110223

克伦特罗-D9286.1204100153

克伦特罗277259.110053

克伦特罗277203100123

沙丁胺醇-D3243.1151.190163

沙丁胺醇2402229053

沙丁胺醇24014890153

表1 三种β-受体激动剂质谱条件

化合物线性范围/（μg/L）线性曲线R2克伦特罗（Clen）0.5 ～ 10y=1.147474*X-0.0356170.9990沙丁胺醇（Sal）0.5 ～ 10y=0.871025*X-0.0194700.9984莱克多巴胺（Rac）0.5 ～ 10y=1.139701*X-0.0422660.9987

表2 三种β-受体激动剂线性关系

图1 三种β-受体激动剂MRM 监测图谱

mL 0.1%甲酸溶液溶解残渣，注射器吸取后过0.22 μm水系膜于进样瓶中，待检测。

仪器条件。液相条件：色谱柱：Poroshell 120 EC-C18 3.0×50 mm 2.7-Micron流动相A(0.1%甲酸水)B（乙腈）；梯度条件：0-1 min A 90%-60%;1-3 min A 60%-5%；3-5 min A 5%-5%;5-7 min 5%-90%。离子源为电喷雾离子源；正离子模式下多重反应检测；毛细管电压：4000 V；离子源温度：350 ℃；脱溶剂气压力：40 psi；脱溶剂气流量11 L/ min。MRM 分析参数见表1。

检测结果及分析讨论：通过试验得出克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺在0.5-10μg/ L的范围内线性关系良好，R2均大于0.998以上。见表2。

提取三种化合物的质谱图发现三种标准物

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