创新化学实验与研究基金资助项目答辩

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D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究
结论
从实验结果可以看出，本实验提出的采用高效毛 细管电泳-非接触式电导法，以铜-L-精氨酸作为配体 交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二 元手性选择体系分离检测D-丝氨酸的新方法，高效简 便、环境友好、成本低、检出限低，可用于实际样品 的分析应用。
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运行液体系：
3.0 mmol/L NaOH+0.4 mmol/L Cit +2.5 mmol/L Cu(Ac)2+5.0 mmol/L L-Arg +10.0 mg/L HPMC（pH=9.67）
最佳实验条件
重力进样，进样时间为60s 分离电压为13kV
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D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究
拆分机理初步探讨
根据(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)稳定性和 光学结构的差异，引起二者电泳淌度的不同，D,LSer得到分离，本实验中L-Ser比D-Ser先流出。 由于(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)的稳定性 系数差异不够大，丝氨酸对映体分离度较小。缓冲 溶液中加入HPMC后，HPMC与Cu(Ⅱ)-L-Arg形成 二元手性选择体系，D,L-Ser分离度提高。
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缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响
NaOH-Cit体系在非接触电导检测法中有良好的基线和灵 敏的响应，但缓冲溶液浓度太高易引起基线漂移。通过实 验发现，柠檬酸浓度对对映体分离的影响很大，浓度太低， 丝氨酸不出峰；浓度太高，水峰提前，对映体也得不到分 离，见下表。 表1 柠檬酸浓度对分离度的影响
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进样方式的选择
图6 进样时间对分离度的影响 Fig.6 The effect of injection time on the resolution 进样时间为60s时分离度最高，Rs=2.6。
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研究方案
本课题提出采用高效毛细管电泳-非接触式 电导法，以铜-L-精氨酸作为配体交换选择 剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二 元手性选择体系，建立快速、灵敏和低成本 的D-丝氨酸的分离分析新方法。
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CCit (mmol/L) Resolution (Rs) 0.2 -0.4 2.3 0.6 1.8 0.8 -1.0 --
故实验选择Cit浓度为0.4 mmol/L。
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缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响
固定柠檬酸浓度后，加入NaOH以调节运行液的pH。在2～4 mmol/L浓度范围内考察NaOH浓度对分离度的影响，见表2。
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L-精氨酸浓度对分离度的影响
图3 L-精氨酸浓度对分离度的影响 Fig.3 The effect of L-Arg concentration on the resolution 本实验选择L-精氨酸的最佳浓度为5.0 mmol/L。
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创新化学实验与研究基金资助项目答辩
D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导 分离检测研究
专业：化学工程与工艺 导师：谢天尧 副教授 报告人：韦昱 07306407
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研究方案 研究背景
实验及 讨论 结论
选题 意义
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图5 pH对分离度的影响 Fig.5 The effect of pH on the resolution
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进样方式的选择
1
电动进样
对离子组分存在 进样歧视
2
重力进样
无进样歧视
3
扩散进样
进样具双向性， 有进样歧视
故本实验采用重力进样。
表4 分离电压对迁移时间和分离度的影响
working voltage (kV) Resolution (Rs) Migrating time of DSer(min) 10 12 13√ 14 15
2.6
48.8
2.3
32.7
2.0
26.5
1.8
23.5
1.6
21.8
故实验选择Cit浓度为0.4 mmol/L。
表2 NaOH浓度对分离度的影响
CNaOH (mmol/L) Resolution (Rs) 2.0 0.9 2.4 1.6 3.0 2.4 3.4 1.9 4.0 1.9
故实验选择NaOH浓度为3.0 mmol/L。
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缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响
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铜离子浓度对分离度的影响
2 .2
2 .0
Rs
1 .8 1 .6
2 .0
2 .2
2 .4
2 .6
2 .8
C /m m o l· L
-1
图2 Cu(Ⅱ)浓度对分离度的影响 Fig.2 The effect of Cu(Ⅱ) concentration on the resolution 本实验选择Cu(Ⅱ)的最佳浓度为2.5mmol/L。
• 最佳实验条件的确定
• 线性范围、重现性、检出限测定
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仪器
CES2008型毛细管电泳仪
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实验试剂
氢氧化钠(NaOH，广州化学试剂厂，分析纯)、柠 檬酸(Cit，广州化学试剂厂，分析纯)、乙酸铜 (Cu(CH3COO)2· 2O，天津市科密欧化学试剂开发 H 中心，分析纯)、羟丙基甲基纤维素(HPMC，山东 赫达股份有限公司，分析纯)、D,L-丝氨酸、L-丝氨 酸(D,L-Ser、L-Ser，国药集团化学试剂有限公司， 层析纯)、L-精氨酸(L-Arg，上海伯奥生物科技有限 公司，层析纯)。所用水为超纯水。
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线性范围与检出限
图7 D-丝氨酸线性校正曲线图 表5 线性范围与检出限
待测组分 D-丝氨酸 回归方程 y=-123.8+ 981.9x 相关系数 r= 0.9999 线性范围 检出限 （mg/L） （mg/L） 1～100 0.5
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拆分机理初步探讨
在缓冲溶液中，铜离子与L-精氨酸以1∶2形成三元 络合物： L-Arg+Cu(Ⅱ)⇋(L-Arg)Cu L-Arg+(L-Arg)Cu(Ⅱ)⇋Cu(L-Arg)2 当丝氨酸对映体进入缓冲系统时，D-Ser和L-Ser分 别取代一分子的L-Arg,形成两种不同的三元络合物: L-Ser+Cu(L-Arg)2⇋(L-Arg)Cu(L-Ser)+ L-Arg D-Ser+Cu(L-Arg)2⇋(L-Arg)Cu(D-Ser)+ L-Arg
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研究背景
如何分离检测D-丝氨酸？ 针对其外消旋体的拆分已开发了优先结晶法、形 成非对映体立体异构体结晶法、酶促法、色谱法 （包括：液相色谱、气相色谱、薄层色谱、配位 色谱、离子交换色谱）毛细管电泳法和萃取法等。 存在的问题： 丝氨酸由于其结构简单，分离难度较大，且没有 紫外或荧光吸收，常需衍生后才可得到检测。
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HPMC浓度对分离度的影响
2.6 2.4
2.2
Rs
2.0
1.8
1.6
1.4 0 5 10 15
-1
20
C/mg· L
图4 HPMC浓度对分离度的影响 Fig.4 The effect of HPMC concentration on the resolution 因此，本实验选择HPMC最佳浓度为10 mg/L。
a
0
S ig n a l/m V U
5
b
S ig n a l/m V
0
-50
-5
-100
L
D
-10
L
D
-150 26.0 27.0 28.0 29.0 30.0 31.0
27.0 28.0 29.0 30.0 31.0 32.0 33.0
t/min
t/m in
图1 两种不同的手性选择体系对分离度的影响 Fig. 1 The effect of two different chiral selectors on the resolution a.Cu(Ⅱ)-L-Arg b. √ Cu(Ⅱ)-L-Arg-HPMC
分离分析原理
毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管 为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行 为上的差异而实现高效，快速的新型液相分离分析 技术；而非接触式电导检测器是近年发展起来的一 种新型电导检测方法。
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实验部分 • 仪器和试剂 • 手性选择体系的选择
1061
1460 2119 2683 2916 2962 故实验选择Cit浓度为0.4 mmol/L。4570 1683 2688 3384 3354 3468 5065
1444
1102
1850
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分离电压的选择
本实验考察了分离电压从10kV至15kV对丝氨酸对映体分离的 影响，见表4。
进样方式的选择
此外，进样时间还对峰高及峰面积有较大影响，见表3。 表3 进样时间的影响
进样时间 （s） LSer DSer 30 49 40 55 50 74 60 84 70 100 80 105 100 139 120 64
峰 高
51
68
92
109
122
129
170
82
Байду номын сангаас峰 面 积
LSer
DSer
如何建立D-Ser有效检测的快速方法，大大降低检测成本， 仍是分析工作者面临的具有挑战性的课题。
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研究背景
高效毛细管电泳（HPCE）是一类以毛细管为 分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液 相分离分析技术，因具有低耗、快速、高效、 环境友好等特点而成为新兴的手性分离分析中 极具吸引力的分析方法。非接触电导检测是近 年来出现的新的检测技术，对于缺乏紫外-可见 吸收基团氨基酸则无须先作衍生化处理,可以进 行直接检测。
峰面积
结果表明：实验证明本方法具有较高的灵敏度和良好 的重现性。
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实际样品分析
60 40
Signal/mV
20
0
-20
D-Serine
-40 -4.1
0.0
4.1
8.3
12.4
16.5
20.7
24.8
28.9
33.1
t/min
图8 D-丝氨酸小鼠脊髓样品HPCE-C4D谱图 Fig.8 The electropherogram of D-Ser in rat spinal cord
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手性选择体系的选择
仅用Cu(Ⅱ) 丝氨酸对映体未 能达到分离
Cu(Ⅱ)+ L-Arg
分离度Rs=1.6
Cu(Ⅱ)-L-Arg +HPMC
分离度Rs=2.1
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手性选择体系的选择
50
10
选题意义
D-丝氨酸是哺乳动物脑内NMDA型谷氨酸受体 (NR1/NR2型)的辅助激动剂，在动物的大脑中一 生都维持着很高的浓度；脑内的神经元和胶质细 胞都含有D-丝氨酸并且具有特异的生物合成、胞 外释放、摄取和降解途径。 D-丝氨酸作为一种重要的胶质细胞递质，在中枢 神经系统参与调节突触可塑性、感觉信息传递、 神经发育及神经兴奋性毒性等生理及病理过程, 并逐渐成为阿尔采末病(AD)等神经系统疾病新的 治疗靶点。
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重现性测定
在相同条件下，D-Ser以3 mg/L的浓度重复进样4次，测其重 现性，见表6。
表6 重现性测定
序号 迁移时间 （min） 1 23.1 2400 2 24.7 2473 3 22.6 2616 4 23.3 2680 RSD/% 3.9 5.0
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