Plackett-Burman设计与响应面法对姬松茸菌丝体多糖提取工艺的优化

Plackett-Burman设计与响应面法对姬松茸菌丝体多糖提取
工艺的优化
曹新志;赵迎庆;熊俐;李琳琳;任林生
【摘要】以姬松茸(Agaricus blazei Murrill)液体发酵菌丝体为原料,用热水浸提的方法对姬松茸菌丝体多糖提取工艺进行研究,通过单因素试验确定了多糖含量最大时,超声波功率为250W、超声波时间30min、浸提温度85℃、浸提时间3h、料液比1∶20、提取3次.在单因素试验的基础上,运用Plackett-Burman设计,筛选出对姬松茸菌丝体多糖提取影响较大的3个关键因素包括超声波强度,浸提温度和浸提时间,然后利用中心复合试验确定主要影响因素的最佳工艺条件:在超声波功率为275W、浸提时间3h、浸提温度83.2℃条件下姬松茸菌丝体多糖含量的实测值为3.187 mg/mL,与理论值3.190 mg/mL的相对误差仅为0.094％.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2014(053)014
【总页数】6页(P3373-3378)
【关键词】姬松茸(Agaricus blazei Murrill);菌丝体多糖;Plackett-Burman;响应面法
【作者】曹新志;赵迎庆;熊俐;李琳琳;任林生
【作者单位】四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000;四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000;四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000;四川理工
学院生物工程学院,四川自贡643000;四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000
【正文语种】中文
【中图分类】TS272
姬松茸（Agaricus blazei Murrill）又名“巴西蘑菇”，是一种珍稀的食药真菌[1，2]，相关研究表明，姬松茸具有药理和保健功效[3]，如增强免疫[4]、抗氧化[5]、调节血糖、降低血脂等生物活性[6，7]，因此对姬松茸的研究有着广阔的发展前景。

目前已经实现了对姬松茸的人工栽培，但是姬松茸子实体培养还是比较困难，同时在产量上、时间上的局限性远不能达到市场需求，相关研究表明[2，8]，无论是子实体还是菌丝体提取的姬松茸多糖在组成上没有本质的差别，另外利用液体方式培养姬松茸还具有周期短、成本低、污染率低、易于控制等优点[9]，所以目前多采
用液体培养的方式实现对姬松茸菌丝体的大规模生产[10]。

采用稀酸或者稀碱提取多糖容易增加提取液的黏度，不利于进一步的浓缩纯化，同时容易破坏多糖的结构[11，12]，所以本试验采用热水浸提的方式提取姬松茸多糖，同时用超声波辅助处理，这样有利于多糖的溶出。

目前在物质提取、发酵工艺优化、以及生产实际中运用 Plackett－Burman[13－15]设计与中心复合试验（Box－Behnken）相结合[16－18]的方式进行试验设计
和数据处理的较多，但是在姬松茸菌丝体多糖提取工艺优化方面应用的相对较少，本试验采用Plackett－Burman设计与中心复合试验相结合的方式，这样可以快
捷地筛选出试验因素中影响较显著的因素，然后通过Design－expert 8.0软件进行响应面分析，确定最优工艺条件。

1 材料与方法
1.1 试验材料
姬松茸斜面菌种来自华中农业大学菌种保藏中心，姬松茸菌丝体来自前期姬松茸液体发酵培养。

1.2 试验方法
1.2.1 种子培养基马铃薯 200 g，麸皮 10 g，蔗糖20 g，KH2PO42 g，
MgSO40.2 g，去离子水 1 000 mL，pH自然。

1.2.2 液体发酵培养基蔗糖 57.5 g，工业玉米浆2.05 g，KH2PO42 g，
MgSO40.2 g，VB10.1 g，1 000 mL水，pH 6.5。

1.2.3 菌丝体发酵培养在酒精圈火焰保护下，按6%接种量接种到装有70%液体发酵培养基的发酵罐中，在25 ℃、150 r／min、0.2 m3／h、pH 6.5 条件下培养
4 d。

1.2.4 材料预处理发酵液经 2 500 r／min离心得菌丝体，然后用去离子水反复洗
涤抽滤4～5次，60 ℃条件下[19，20]在恒温干燥箱内干燥至恒重。

干燥的姬松
茸菌丝体用高速捣碎机破碎，然后过60目筛，菌丝体粉末放置在4℃冰箱里备用。

1.2.5 提取方法用分析天平准确称取1 g姬松茸菌丝体粉末，加入一定比例的去离子水，然后用超声波细胞破碎仪处理，在一定条件下进行提取，每组做3次重复，过滤得提取液，取提取液在55℃条件下减压浓缩至50 mL，加入无水乙醇至浓度80%沉淀过夜[21，22]，离心得粗多糖。

1.2.6 多糖的测定采用硫酸－苯酚法[23]测定多糖含量，标准曲线见图1。

图1 硫酸-苯酚法测定多糖标准曲线
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声波功率对姬松茸菌丝体多糖含量的影响考察不同的超声波功率对姬松茸菌丝体多糖提取影响时，在超声波时间20 min、料液比1∶15（m/V，g∶mL，
下同）、浸提温度90 ℃、浸提时间 2.5 h、提取1次的条件下，选取超声波功率
分别为200、250、300、350、400、450、500 W 进行试验，结果见图2。

由
图2可知，当超声波功率为250 W时，多糖含量最大为2.001 mg／mL，但当超声波功率超过250 W时，多糖含量则呈现下降的趋势，这可能由于超声波产生的空穴效应，随着强度的增加，剧烈的高速冲击使得糖苷键发生断裂，而使得多糖含量在超声波功率超过250 W时呈现下降趋势。

图2 超声波功率对姬松茸菌丝体多糖含量的影响
图3 超声波时间对姬松茸菌丝体多糖提取的影响
2.1.2 超声波时间对姬松茸菌丝体多糖含量的影响考察不同的超声波作用时间对姬松茸多糖提取的影响时，在超声波功率250 W、料液比1∶15、浸提温度90℃、浸提时间2.5 h、提取1次的条件下，选择超声波时间分别为 20、30、40、50 min进行试验，结果见图3。

采用超声波辅助热水浸提多糖，超声波产生的空化作用加速了多糖从菌丝体里溶出。

由图3可知，当超声波作用时间为30 min时，多糖含量达到最大值2.097 mg／mL，当作用时间超过30 min时，多糖含量呈现下降趋势，因为在30 min以前超声波的空化作用造成姬松茸菌丝体外壁不断的破碎，使得多糖不断的溶出，从而多糖含量呈现上升趋势，但是当作用时间超过30 min 时，由于超声波作用时间的延长空化效应引起的高速冲击的不断作用使得糖苷键断裂，所以此时的超声波还起到了降解多糖的作用，所以多糖含量呈现下降趋势。

2.1.3 料液比对姬松茸菌丝体多糖含量的影响进行不同料液比对菌丝体多糖含量的影响试验时，在超声波时间30 min、超声波功率250 W、浸提温度90℃、浸提
时间2.5 h、提取1次的条件下，选择料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、
1∶25、1∶30 进行试验，结果如图4。

在浸提工艺中料液比是一项不可忽视的考
察因素，因为浸提工艺都需要有溶剂作为浸提的媒介。

试验中对料液比的考察主要是为了找到一个料液比例，这样既能得到最大量的多糖，又不会过多的浪费水资源。

由图4可知，当料液比1∶20时多糖含量最大为2.141 mg／mL，由于菌丝体中
多糖含量是有限的，所以当料液比超过1：20时，多糖溶出达到一个平衡的临界点，所以多糖含量变化不明显，因此确定姬松茸多糖提取的料液比定为1∶20。

图4 料液比对姬松茸菌丝体多糖提取的影响
2.1.4 浸提温度对姬松茸菌丝体多糖含量的影响考察不同的浸提温度对姬松茸菌丝体多糖提取影响时，在超声波时间30 min、超声波功率250 W、料液比1∶20、浸提时间 2.5 h、提取 1 次的条件下，选择浸提温度分别为 75、80、85、90、95、100 ℃进行试验，结果如图5。

由图5可知，温度在75～85℃时，多糖含量随着温度的升高而增加，在85℃时含量达到最大值2.127 mg／mL，但当温度超过这一温度时多糖含量则呈现下降趋势，姬松茸生物活性多糖有的为多糖与蛋白的复合物，当温度升高时引起糖蛋白变性或者温度的升高引起糖苷键的断裂，温度超过85℃时多糖含量呈现下降趋势。

图5 浸提温度对姬松茸菌丝体多糖提取的影响
2.1.5 浸提时间对姬松茸菌丝体多糖提取的影响考察不同的浸提时间对姬松茸菌丝体多糖提取影响时，在超声波时间30 min、超声波功率250 W、料液比1∶20、浸提温度85℃、提取1次的条件下，选择浸提时间分别为 1.5、2.0、2.5、
3.0、3.5 h 进行试验，结果如图6。

由图6可知，在浸提时间1.5～3 h范围内变化时，多糖含量随着浸提时间的延长而增加，当浸提时间为3 h时多糖含量最大为2.139 mg／mL，但当时间延长的时候，多糖含量变化不大或呈下降态势，所以确定最
佳的浸提时间为3.0 h。

图6 浸提时间对姬松茸菌丝体多糖提取的影响
2.1.6 提取次数对姬松茸菌丝体多糖提取的影响考察不同的提取次数对姬松茸菌丝体多糖提取影响时，在超声波时间30 min、超声波功率250 W、料液比1∶20、浸提温度85℃、浸提时间3 h的条件下，选择提取次数分别为 1、2、3、4、5 次
进行试验，结果如图7。

由图7可知，当提取次数为3次时多糖含量最大为 1.993 mg／mL，当提取次数在 1～3 之间时，每次多糖含量的增加量均达到 0.10～
0.14 mg／mL，当提取次数超过3时，多糖含量增加量变化不大，从经济方面考
虑应以3次为宜，超过3次会增加经济投入，同时也不利于后面的浓缩处理，所
以确定提取次数为3。

图7 提取次数对姬松茸菌丝体多糖提取的影响
2.2 Plackett－Burman 试验结果
试验中影响姬松茸菌丝体多糖提取的因素有超声波强度、超声波时间、浸提温度、浸提时间、料液比、提取次数，在单因素试验的基础上，确定了各影响因素的水平，为进一步确定各因素对多糖提取影响的主次顺序，利用Design－expert 8.0软件进行了Plackett－Burman试验设计，设计结果及响应值见表1、表2。

由表2中的“Prob＞F值”可以得出影响多糖提取的主次顺序依次是超声波功率、浸提温度、浸提时间、料液比、超声波时间、提取次数。

对姬松茸菌丝体多糖提取有显著性影响的因素有超声波功率、浸提温度、浸提时间。

所以在接下来的研究试验中对超声波功率、浸提温度、浸提时间3个影响因素进行进一步的试验。

表1 Plackett-Burman试验设计结果试验号2 3 7 1 1 10 4 9 6 1 2 5 8 1超声波
功率（A）//W-1（200）1（300）1 1-1-1 1-1-1-1 1 1超声波时间（B）//min 1（40）-1（20）-1-1 1 1 1-1-1-1 1 1浸提温度（C）//℃-1（75）1（95）-1
1 1 1 1-1-1 1-1-1浸提时间（D）//h 1（3.5）1 1 1 1-1（2.5）-1 1-1-1-1 1料液比（E）//g∶mL 1（1∶30）1-1（1∶10）1 1-1-1-1-1 1-1 1提取次数（F）1（4）1 1-1（2）-1-1-1 1-1 1 1 1多糖含量//mg/mL 1.703 1.91
2 2.10
3 2.126 1.665 1.97
4 1.783 1.821 1.74
5 1.824 1.847 2.105
表2 偏回归系数及显著性检验注：“*”表示影响显著（0.01<P<0.05）模型项模型A B C D E F回归系数自由度F值0.076 0-0.018 0-0.029 0 0.069 0 0.069 0
0.004 1 5 1 1 1 1 1 1均方0.033 0 0.069 0 0.004 0 0.010 0 0.058 0 0.057 0
0.000 2 5.050 0 10.560 0 0.620 0 1.550 0 8.790 0 8.740 0 0.031 0 Prob＞F 0.048 1 0.022 7 0.466 2 0.031 4 0.031 6 0.268 3 0.868 1显著性** **
2.3 中心复合试验设计
根据Plackett－Burman试验设计结果进行Box－Behnken试验设计，以超声波
功率、浸提时间、浸提温度为自变量，分别用 X1、X2、X3表示，并用－1、0、1代表编码水平，以多糖含量作为响应值，Box－Behnken试验设计及结果见表3、表4。

经过二次多项回归拟合后，得到以下回归方程预测模型：
Y ＝－113.786 55 ＋1.020 32X1＋30.863 9X2＋1.035 58X3－0.120 1X1X2－0.002 4X1X3－0.070 4X2X3－0.004 2X12－3.084X22－0.004 2X32，其中 Y
代表多糖含量，X1、X2、X3分别代表超声波功率、浸提时间、浸提温度。

表3 Box-Behnken试验设计及结果试验号6 2 1 2 13 17 14 15 7 3 5 1 1 1 1 0
9 1 6 4 8超声波功率（X1）W 1（300）1 0（250）0 0 0 0－1（200）－1－1
0－1 0 0 0 1 1浸提时间（X2）h 0（3）－1（2.5）1（3.5）0 0 0 0 0 1 0－1－
1 1.－1 0 1 0浸提温度（X3）℃－1（80）0（85）1（90）0 0 0 0 1 0－1 1 0
－1－1 0 0 1多糖含量mg/mL 2.928 2.753 2.252 3.162 3.175 3.184 3.052
2.503 2.303 2.309 2.192 0.753 2.655 1.891
3.038 1.901 2.636
由表4可知，该模型的总体P＜0.000 1说明模型达到极其显著的水平，回归方程可用，模型的决定系数R2为0.982 2说明该回归方程可以准确的反应不同的提取条件对姬松茸菌丝体多糖提取的影响，可以用回归方程来代替真实试验点来对姬松茸多糖提取进行分析和预测。

校正系数Radj2为0.959 2，说明该模型只有4.08%的概率不能解释响应面值的变化。

失拟项P值0.057 6不显著，说明所得方程与
实际拟合中的非正常误差所占的比例小，另外模型各项 X1、X2、X3、X1X2、
X1X3、X2X3、X12、X22、X32 中除X3、X1X3、X32不显著外，其余项都显著，
这说明所以预测值与实测值有着良好的拟合性，因此，该模型对姬松茸菌丝体多糖提取提供了一个很好分析预测模型。

表4 回归模型方差分析注：“**”表示影响极显著（P<0.01）,“*”表示影响显
著（0.01<P<0.05）。

来源模型X1 X2 X3 X1X2 X1X3 X2X3 X12 X22 X32自由
度F值P值平方和6.150 0 0.690 0 0.290 0 0.005 0 1.440 0 0.059 0 0.120 0
0.760 0 2.500 0 0.046 0 0.110 0 0.091 0 0.020 0 6.260 0 0.982 2 0.959 2
0.761 1 23.529 0显著性<0.000 1 0.000 3 0.003 7 0.593 0<0.000 1 0.095 8 0.027 0 0.000 2<0.000 1 0.134 6均方0.680 0 0.690 0 0.290 0 0.005 0 1.440
0 0.059 0 0.120 0 0.760 0 2.500 0 0.046 0 0.016 0 0.030 0 0.005 1 9 1 1 1 1 1
1 1 1 1 7 3 4 1 6 42.810 0 43.280 0 18.150 0 0.310 0 90.420 0 3.700 0 7.770 0 47.480 0 156.750 0 2.860 0** **残差失拟项纯误差总差决定系数R2校正系数
R2adj预测R2pre信噪比6.030 00.057 6
利用Design－expert 8.0软件对二次回归模型进行分析，得到超声波功率、浸提温度、浸提时间3个因素之间的立体分析图，图8至图10分别表示了超声波功率、浸提温度、浸提时间之间交互作用对姬松茸菌丝体多糖提取影响的响应面图，结合图8至图10及Design－expert 8.0软件综合分析得到提取姬松茸菌丝体多糖最
优条件是超声波功率为269.45 W、浸提 3.01 h、浸提温度为83.21 ℃，此时多
糖含量达到3.190 mg／mL。

考虑到实际超声波细胞破碎仪的最小调节范围以及
水浴锅温度和时间控制范围，所以对预测值进行如下修正：超声波功率为275 W、浸提3 h、浸提温度为83.2℃。

图8 超声波功率与浸提时间对姬松茸菌丝体多糖提取的响应面
图9 浸提时间与浸提温度对姬松茸菌丝体多糖提取的响应面
图10 超声波功率与浸提温度对姬松茸菌丝体多糖提取的响应面
为了证实上述优化条件的正确性，根据优化条件进行验证性放大试验，准确称取
10 g姬松茸菌丝体粉末，用优化后的条件处理试验材料，测量其多糖含量，结果
多糖含量达到 3.187 mg／mL，这与试验的预测值接近，同理论值相比，相对误
差仅有0.094%，因此采用响应面优化得到的姬松茸菌丝体多糖提取的工艺条件具有一定的可靠性和真实性。

3 结论
本试验用热水浸提的方法提取姬松茸菌丝体多糖，比较全面的考察了各影响因素对姬松茸菌丝体多糖提取的影响。

通过单因素试验确定了多糖含量最大时，各因素的取值点为超声波功率250 W、超声波时间30 min、浸提温度85℃、浸提时间3 h、料液比1∶20、提取 3 次。

试验中还将 Plackett－Burman设计与 Box－Behnken试验相结合，通过Plackett－Burman设计快速筛选出影响试验的关键因素：超声波功率、浸提温度、浸提时间，然后通过响应面的方法确定关键因素对姬松茸菌丝体多糖的提取工艺最佳条件：超声波功率为275 W、浸提 3 h、浸提温度83.2℃，其他条件：超声波
时间30 min、料液比1∶20、提取3次，此时姬松茸菌丝体多糖的含量为3.187 mg／mL，预测值为 3.190 mg／mL。

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