猪繁殖和呼吸综合征病毒分离与鉴定X

南京农业大学学报　1997,20(3):82～86
Journal of N anji ng A gricult ural U niversity
猪繁殖和呼吸综合征病毒分离与鉴定Ξ
姜　平　简中友　马志永　蔡家利　蔡宝祥
(南京农业大学畜禽传染病研究室,南京210095)
摘要　在对国内某地区7个患病猪群流行病学调查的基础上,用Marc2145细胞培养从4个猪群流产胎儿分离到3株导致细胞病变的病毒———J1、J2和J3株。

它们对氯仿和热(56℃,1h)、甲醛、酸、碱均敏感。

病毒粒子呈球状,直径30～80nm,负染后病毒粒子大小80～100nm,在Marc2145细胞质内增殖,52溴22′2脱氧尿核苷(BUDR)对其无抑制作用。

结合血清学试验,鉴定3个毒株均为猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV),可能为美洲型PRRSV。

关键词　猪繁殖和呼吸综合征病毒;分离;鉴定
中图分类号　S8581280153
ISOLATION AN D IDENTIFICATION OF PORCINE REPR OD UCTIVE
AN D RESPIRAT OR Y SY N D R OME(PRRS)VIRUS IN CHINA
Jiang Ping,Jian Zhongyou,Ma Zhiyong,Cai Jiali and Cai Baoxiang
(Animal Infectious Disease Lab,Nanjing Agric Univ,Nanjing210095)
ABSTRACT　On base of the epizootiology of seven pig herds with porcine reproductive and res piratory syndrome (PRRS)outbreaks in China,three virus strains were isolated from aborted fetues in the herds on Marc2145cell culture.The three isolates,designated as J1,J2and J3,could cause cytopathic effects(CPE),which could not be inhibited by BUDR.The causal virus did not resist treatments with chloroform,p H5.0,p H8.0and56℃, and decreased significantly in infectivity when exposed to0.2%formalin for2h at37℃.The diameter of the virus detected in cytoplasm of Marc2145cells was30280nm,but in negatively stained electron micrographs was 802100nm.They showed serological relationship to the American serotype of PRRS virus.The results confirmed that PRRS virus was present in China.
K ey w ords　porcine reproductive and res piratory syndrome virus;isolation;identification
猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种新的、高度传染性猪病,临床上以母猪发热、厌食、流产、木乃伊胎、死产、弱仔等繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状和高死亡率为特征[1]。

该病自1987年美国首次报道以来,世界上很多国家都相继报道,并分离到病毒。

该病已造成世界养猪业严重经济损失[2～8]。

目前中国也已存在该病,并已有分离病毒方面的研究报道[9],但对PRRSV尚无详细研究。

作者对国内某地区繁殖障碍猪群进行了详细的流行病学调查,对可疑病料用细胞培养分离病毒,并进行了系
Ξ国家自然科学基金资助项目(39570546)及江苏省九五重点攻关项目(BE96404)
收稿日期:1996210208
统鉴定。

1　材料与方法
111　疫情调查及采样
1996年3月对国内某地区7个患有繁殖障碍的猪群按常规方法进行流行病学、临床症
状调查,血清抗体检测。

剖检流产胎儿及死亡仔猪,同时无菌采取肺、肝和脾,-20℃保存
备用。

112　E L ISA 法检测PRRSV 抗体
根据临床症状共采集41份血清,按试剂盒说明(美国,Herd Chek ,IDEXX )检测PRRSV 抗体,同时用猪细小病毒(中国农业大学)和布氏杆菌标准抗原(中国兽药监察所)分别检测猪细小病毒和布氏杆菌抗体。

113　Marc 2145细胞培养
按K im 等[10]方法进行。

Marc 2145细胞由长春农牧大学殷震院士提供。

生长液为含体积分数(φ)8%犊牛血清的Eagle 氏M EM 营养液,p H 7.2。

114　病毒分离
参考Collins 等方法[2]将肺、肝、脾捣碎后用3～5倍(体积)无血清Eagle 氏M EM 营养
液制成悬液,冻融3次,1000r/min 离心20min ;取上清液用微孔滤膜过滤除菌,于-50℃保存备用,或接种于48～72h 形成单层的Marc 2145细胞,1ml/瓶;37℃吸附12～16h 后加入含φ=4%犊牛血清的Eagle 氏M EM 营养液,继续培养6～9d 。

每天观察细胞病变(CPE ),当CPE 达70%时收毒,未出现CPE 者,经冻融3次后盲传3～5代。

115　病毒理化特性测定
用Marc 2145细胞按常规法进行病毒热敏感试验、耐酸性试验、氯仿敏感试验、甲醛敏感性试验及核酸型鉴定。

116　直接免疫荧光染色将出现CPE 的细胞培养物接种Marc 2145细胞,培养24～48h 后,冷丙酮固定10min ,用PBS 漂洗3次,加入适量1∶20PRRSV 荧光抗体(德国研制,上海兽医站龚国华提供)37℃温浴1h ,用PBS 漂洗3次。

同时设定Marc 2145细胞对照。

在荧光显微镜下检查。

117　中和试验
将3个分离株分别加适量美洲型PRRSV 抗血清(美国Illinois 大学Jin 博士提供),37℃作用1h 。

同时设阴性血清对照。

测定病毒TCID 50,计算中和指数。

118　超薄切片检查
取第5代细胞毒接种于Marc 2145细胞单层,37℃培养24～48h 。

按常规法制成超薄切片,用醋酸铀2柠檬酸铅双染后在电子显微镜下观察。

119　超速离心及电镜观察将第6代细胞培养物冻融3次,6000r/min 离心3min ,取上清液,30000r/min 离心2h (55.2Ti Bechman ,L8255M ),用PBS 悬浮沉淀,浓缩200倍,负染后作电镜观察。

3
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2　结　果
211　流行病学调查及血清抗体检测
1996年3月,对国内某地区7个发病猪场进行了详细询问、临床观察及病理剖检,发现
这些猪场于1995年12月至1996年3
月均受到不明原因的猪病侵袭。

主要表现为妊娠母猪厌食、体温40～41℃、流产、死胎、弱仔、木乃伊胎及母猪无乳症。

发病率84%～90%,弱仔率2213%～3714%,死仔率1217%～5915%,木乃伊胎率012%。

死产胎儿主要表现水肿,皮肤呈棕褐色,病理剖检无特征性变化。

仔猪育成率约63%～65%。

少数弱仔肺弓形虫检查呈阳性。

常表现为突然发病,2～3周呈发病高峰,以后逐渐恢复;但仔猪育成率长期较低,康复母猪受孕率50%,发情推迟。

饲养条件较差的患病猪群,则病程和恢复期延长。

病猪群与猪品种无关。

初产母猪和经产母猪均可发病。

发病前后无更换饲料史。

公猪临床表现不明显,但配种率降低。

少数育成猪和肥猪出现咳嗽、打喷嚏等呼吸道症状,偶尔出现耳部和四肢内侧发绀及酱油样腹泻,但无特征性病理解剖学变化。

用PRRSV EL ISA 试剂盒检测了41份血清样品,结果6个猪场的24份血清存在PRRSV 阳性抗体。

6个发病猪场的流产母猪PRRSV 血清阳性率为7317%,异常仔猪血清
阳性率为3815%,育成猪血清阳性率为50%,1份公猪血清也存在PRRSV 阳性抗体。

而布氏杆菌和细小病毒抗体检测结果均为阴性。

212　病毒分离
用Marc 2145细胞培养对4个猪场的流产胎儿或弱仔肺、肝、脾病料进行病毒分离,结果3个猪场的病料在该细胞上盲传2～3代,培养72～96h 后可见CPE (图1)。

连续传代到第6代,CPE 出现时间稳定,表现为细胞变圆,折光性增强,灶状脱落,呈现大片空洞。

病毒TCID 50达105/ml 。

图1　分离毒株致Marc 2145细胞病变
Fig.1　A Cytopathic effect (CPE )caused by isolate on Marc 2145cell culture
A 1感染细胞infected cells ;
B 1正常细胞normal cells
213　病毒理化特性
3个分离株经不同方法处理后,接种于Marc 2145细胞单层的96孔培养板培养120h ,
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以CPE 为判定标准,按Reed 2Muench 法计算TCID 50。

表1结果表明这3个分离毒株对氯仿敏感,对热(56℃
)敏感,不耐酸(p H 5.0),不耐碱(p H 8.0),病毒核酸复制以RNA 形式出现。

214　血清学试验
用PRRSV 荧光抗体对3个分离病毒感染的细胞染色,结果于Marc 2145细胞胞浆内均出现特异性荧光反应。

美洲型PRRSV 抗血清对J 1、J 2和J 3的中和指数均达100以上,表明3个分离株的抗原性与PRRSV 一致,血清型很可能为美洲型。

表1　不同处理方法对分离株稳定性的影响
T able 1　Infectivity of isolated virus following treatment with various methods
处理方法
Treatment methods TCID 50/ml (log10)J1J2J3处理方法
Treatment methods TCID 50/ml (log10)J1J2J3氯仿(
φ
=5%)4℃,24h 000温　度4℃,1h 5.83 5.83 5.5不处理
Untreated 4.83 4.50 4.50Temp 56℃,10min 4.00 4.33 4.33p H 3.0,4℃,18h 000 56℃,30min 1.000.830.83　5.00.330.250.50 56℃,1h
000　7.0 4.33 4.50 4.50甲醛(
φ=012%)2h 000　8.0
0.330.500.33Formalin 12h 000BUDR (60μg/ml ) 4.50-- 24h 000不处理Untreated
4.50
--
不处理Untreated
4.83
4.50
4.50
215　电镜观察
在感染3个分离毒的Marc 2145细胞超薄切片中,感染细胞胞浆内均有散在的病毒颗粒,大小30～80nm (图2)。

在病毒负染样品中,可见大小80～100nm 的球状病毒子(图3)。

表2　病毒中和试验结果
T able 2　R esults of virus neutralization test
毒　株
Isolates TCID 50/ml (5×log10)中和指数
Neutralization index
J1 2.87100.0J2 2.50234.4J3 2.87100.0
Control group 4.87
图2　Marc 2145细胞中PRRSV 的电镜观察　Fig.2　Electron micrograph of PRRSV strain J1
in Marc 2145cells ×15000
图3　PRRSV J1分离毒株负染电镜观察
Fig.3　Electron micrograph of PRRSV strain J1
negative stain with 2%PTA ×30000
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3　小结与讨论
PRRSV属于冠状病毒科动脉炎病毒属成员,根据3个分离株病毒粒子的形态、大小,毒株的理化特性、与荧光抗体的反应、中和试验,以及对该病的流行病学调查,证明该毒株与PRRSV具有相同的抗原关系,属于动脉炎病毒属一员,为PRRSV。

目前,PRRSV有欧洲型和美洲型两个血清型,其抗原性有很大差异,一般美洲型能与欧洲型的抗血清反应,但欧洲型不能与美洲型毒株的抗血清反应。

本试验用美洲型抗体能较好地中和3个分离株,表明其很可能均属于美洲型,但主要结构蛋白基因序列有待进一步测定分析。

虽然郭宝清[9]已从国内发病猪群中分离到PRRSV,但病毒理化特性及形态结构等尚未报道,本试验较为系统地对3个分离株的理化特性进行了测定,结果与Y oon等报道[7,8]相似,56℃、1h,p H3.0、37℃、1h及φ=012%甲醛、37℃、1h,可使病毒失活;56℃、30 min,p H5.0、8.0(37℃、1h)可使病毒滴度下降90%以上。

Marc2145细胞感染后24h即可在细胞浆内出现病毒粒子,直径30～80nm,并使细胞内质网空泡化。

病毒纯化浓缩后负染电镜观察,形态清晰,直径80～100nm。

猪肺泡巨噬细胞(PAM)、Marc2145及CL2601等细胞可用于分离PRRSV,各分离株对其适应性有一定差异。

由于SPF猪肺泡巨噬细胞来源困难,巨噬细胞分裂较慢,操作极易污染,CL2601细胞已被申请专利,所以,Marc2145细胞不失为一种分离病毒的首选细胞。

本试验3个分离株在Marc2145细胞培养中盲传2～3代后即出现较为典型的细胞病变,连续传代至第6代,细胞病变稳定,病毒毒价(TCID50)达105/ml以上。

根据本次发病猪场流行病学调查、血清抗体检测及病毒分离鉴定,进一步证实了我国已经存在该病,有些地区已暴发流行。

研究该病毒致病特性、培养方法、流行范围及有效防制对策十分必要。

参　考　文　献
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(责任编辑　是雅蓓)。