STAT3在喉鳞状细胞癌及手术切缘组织中的表达及临床意义

STAT3在喉鳞状细胞癌及手术切缘组织中的表达及临床意义
目的:探讨信号转导子和转录激活子-3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在喉癌组织中的表达与喉癌临床特征的关系,从细胞和基因水平探讨喉癌手术安全切缘的范围。

方法:分别采用PV-9000免疫组织化学两步法及RT-PCR检测38例喉鳞癌组织及距癌组织边缘2、5、10 mm组织中STAT3的表达及其mRNA转录情况,同时取距离癌组织边缘20 mm以上的正常黏膜作为对照。

结果:STAT3表达依癌组织→癌旁2 mm→癌旁5 mm→癌旁10 mm→正常黏膜顺序递减。

结论:STAT3在喉鳞癌组织中及癌旁各距离组织中的表达情况表明喉癌手术切除范围以距肿瘤边缘5 mm作为安全切缘的标准较为适宜。

[Abstract] Objective: To study the expression of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in laryngeal carcinoma and explore the biological action of laryngeal tumor and the range of safe surgical margin. Methods: 38 cases of laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) specimens and different regions adjacent carcinoma (2, 5, 10 mm) were examined for the expression level of STAT3 protein by IHC method (PV-9000), and RT-PCR was employed to measure the expression of STAT3 mRNA. Normal mucosa (>20 mm) was used as control. Results: The expression of STAT3 decreased as tissue progressed in sequence from carcinoma tissues to 2, 5, 10 mm distant mucosa adjacent carcinoma and normal mucosa. Conclusion: It is appropriate to regard 5 mm away from tumors as resection margins for surgical treatment of laryngeal carcinoma.
[Key words] Laryngeal carcinoma; STAT3; Safe resection margin
喉鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,癌基因的激活与肿瘤的发生、发展密切相关[1-2]。

STAT3已被定义为癌基因,是一种双功能蛋白,与酪氨酸磷酸化信号通道耦联,主要位于细胞质中[3]。

在我国,以手术为主的综合治疗是目前喉癌的主要治疗方法,选择合理的手术切缘是其关键。

本实验旨在通过免疫组织化学和RT-PCR检测STA T3在喉癌及癌旁不同距离组织中的表达情况,从细胞的蛋白水平及基因水平探讨手术安全切缘的范围,为喉癌的诊断与治疗提供理论依据。

1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2008～2009年山西医科大学第一医院耳鼻咽喉科及山西省肿瘤医院喉癌患者38例,均为首次手术,详细记录患者年龄、肿瘤部位、表型、分期、分化及转移情况等。

术前均经病理证实为鳞癌,术前均未进行放疗和化疗等肿瘤学治疗。

每例取5块标本,分别为癌组织(A组)、距癌边缘2 mm(B组)、5 mm(C组)、10 mm(D 组)组织,以>20 mm的正常黏膜组织作为对照(E组)。

一部分标本用10%中性甲醛固定24 h,常规石蜡包埋,连续切片(4 μm),用于免疫组织化学实验及常规病理学检
查;另一部分置于灭菌锡箔纸内,投入液氮罐,放入深低温(-86℃)冰箱保存备用,用于RT-PCR实验。

38例喉癌患者中,男35例,女3例;年龄42～80岁;其中,声门上型19例,声门型13例,跨声门型6例;临床分期按2002年美国癌症联合会(AJCC)分期方案进行,其中,T1期4例,T2期18例,T3期10例,T4期6例;依据病理分化程度类型分为:高分化鳞癌10例,中分化鳞癌19例,低分化鳞癌9例。

全部患者行手术治疗,喉全切除8例,喉扩大次全切除伴发音重建7例,喉部分切除23例;25例行颈淋巴结清扫术,经病理证实有淋巴结转移23例。

术中行多方位切缘冰冻均未见癌细胞。

1.2 试剂
免疫组织化学试剂包括羊抗人STAT3单克隆抗体(Santa Cruz公司,美国),两步法PV-9000免疫组织化学检测试剂和浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)。

RT-PCR试剂包括Trizol Reagent,RT-PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。

1.3 方法
1.3.1免疫组织化学PV-9000两步法参照PV-9000二抗试剂盒检测石蜡标本切片中STAT3蛋白的表达。

先行预试验确定合适的一抗浓度为1∶400。

抗原修复采用热修复。

1.3.2 RT-PCR方法按照Trizol说明书,分别提取各冻存组织总RNA,进行纯度和浓度的鉴定和检测。

将合格的总RNA按RT-PCR试剂盒要求进行逆转录合成cDNA,再加入引物进行PCR扩增,产物用1.5%琼脂糖电泳检测。

PCR引物由Primer 5.0设计,经上海生工公司合成。

STAT3:上游5’-CTG GCC TTT GGT GTT GAA AT-3’,下游5’-AAG GCA CCC ACA GAA ACA AC-3’,产物202 bp。

GAPDH:上游5’-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3’,下游5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’,产物307 bp。

STAT3反应条件为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s;退火:57℃30 s;延伸:72℃40 s,35个循环;最后72℃延伸5 min,产物经1.5%琼脂糖电泳检测,紫外灯下观察并用凝胶成像系统成像。

1.4 结果判定标准
胞核或胞质呈棕黄色为阳性。

光镜下每张切片随机取10个高倍视野(×250),记录每个视野下100个细胞中阳性染色细胞个数,计算阳性百分率后取平均值[4]。

肿瘤细胞着色率0%～5%为(-),着色率6%～29%为(+),着色率≥30%为(++)。

RT-PCR检测结果以出现扩增条带为阳性,应用图像分析软件Quantity One 4.0测定电泳条带。

PCR产物的含量以累积光密度(IOD)表示,IOD=平均光密度×发光面积。

STAT3 mRNA的相对含量以同一标本STAT3与内参照GAPDH的PCR产物含量的比值来表示;重复3次后取平均值。

如无扩增条带,IOD值为0。

1.5 统计学处理
使用SPSS 13.0软件进行统计分析。

显著性检验水准α=0.05。

根据资料性质,按照不同临床病理特征进行分组,采用χ2检验或Fisher精确概率检验法比较两组或多组之间阳性率的差异。

RT-PCR结果采用均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析,组间采用SNK检验。

2 结果
2.1 STAT3蛋白在喉癌组织和癌旁不同距离组织中的表达
STAT3在喉癌组织中阳性表达率为92.11%,在距癌旁2、5、10 mm及正常组织中的阳性表达率分别为84.21%、28.94%、18.42%、10.53%,呈逐渐递减的趋势。

A组与C、D、E组分别比较,差异均有高度统计学意义(均P＜0.01);A组与B组比较,差异无统计学意义(P>0.05);C组与D、E组比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。

见表1及图1、2。

表1 STAT3蛋白在喉癌组织和癌旁不同距离组织中的表达(例)
2.2 STAT3 mRNA在喉癌组织和癌旁不同距离组织中的表达
从A组到E组STAT3 mRNA表达逐渐减弱,五组间差异有高度统计学意义(P ＜0.01)。

经组间多重比较,A组、B组分别与C、D、E组比较,STAT3 mRNA表达差异有统计学意义。

A组与B组之间以及C、D、E组之间差异无统计学意义。

见表2及图3。

表2 STAT3 mRNA在喉癌组织和癌旁不同距离组织中的表达(x±s)
各组数据经分析,方差齐,且呈正态分布。

组间差异性比较采用方差分析。

组间多重比较采用SNK检验,STAT3 mRNA的表达可分为a、b两组(a包括A与B 两组,差异无统计学意义;b包括C、D、E三组,三组间差异无统计学意义)
3 讨论
STAT3是一种信号转导子和转录激活子,可在外界刺激下激活并直接引发相应靶基因的转录[5]。

本实验检测了喉鳞癌及癌旁不同距离处STAT3蛋白及其mRNA的表达水平。

结果显示,喉癌组织中STAT3蛋白的阳性表达率为92.11%,明显高于阳性率为10.53%的正常组织,差异有统计学意义。

喉癌组织中STAT3 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常对照组,并沿着癌组织→癌旁2 mm→癌旁5 mm→癌旁10 mm→正常组织顺序递减。

研究表明,STAT3的过度表达通过上调编码凋亡抑制剂和细胞周期调节剂等的基因表达参与肿瘤的发生及发展[6],它可能成为喉鳞状细胞癌诊断和治疗等研究的病理学靶向指标。

1994年,STAT3作为白细胞介素-6信号传递中的急性期反应因子被纯化[7],具有以下主要部分:①保守的氨基酸末端;②DNA连接区;③SH3结构域;④SH2区;
⑤C末端转录激活结构域[8]。

STAT3在JAK激酶的作用下,通过H2结构域与受
体上的磷酸化Tyr残基结合,使其C端发生磷酸化。

2个磷酸化STA T3分子形成二聚体,继而进入细胞核,与目的基因结合,或可能再经过某种修饰作用诱导基因表达[9]。

研究发现,编码STAT3的基因定位于人类第17号染色体(q21.1～q21.2)[10],STAT3参与人类恶性肿瘤的发生及发展主要依靠其强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用。

目前,手术切除仍是各型喉鳞癌治疗方案中最主要的手段,主要包括全喉切除术及喉部分切除术。

全喉切除会影响患者吞咽功能,使发音功能丧失,呼吸通道发生改变。

在彻底切除喉部肿瘤的基础上尽可能保留发声功能,以提高患者的生存质量,这是现代喉外科手术的基本原则[11]。

因此,科学、合理地确定喉部分切除范围成为重要课题。

喉癌手术切缘的研究,即在查明肿瘤原发灶的基础上,确定恰当的手术切除范围,使患者获得更好的生存率和生存质量。

本研究采用免疫组织化学和RT-PCR检测癌组织及癌旁不同距离组织中STAT3的表达情况,结果显示,STAT3在喉癌组织和对应的癌旁>20 mm处正常组织中有明显的表达差异。

在癌组织向正常组织移行的过程中,其表达水平逐渐降低。

经统计学分析,STAT3在癌组织中表达水平与癌旁5、10 mm及正常组织中差异有统计学意义,与癌旁2 mm处差异无统计学意义。

而癌旁5 mm与10 mm 及正常组织处比较,差异无统计学意义。

据此结果,喉鳞状细胞癌手术切除的范围应该包括距肿瘤边缘5 mm之内的癌旁组织,以距肿瘤边缘5 mm作为安全切缘的标准[12]。

综上所述,STAT3高表达在喉鳞癌的浸润、转移、发生及发展中起重要作用,它可作为反映喉鳞癌生物学行为的一项指标,在术前诊断、手术切缘的判断及术后复发的评估中有一定的参考价值。

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