紫外光谱在医药方面的研究

紫外光谱在医药方面
的研究
[键入文档副标题]
高慧2012012870
2014/6/4
紫外光谱在医药方面的研究
高慧
东北师范大学化学学院
摘要：阐述了几种紫外光谱在医学技术（金属蛋白）及中药（大黄等）上的应用实例
关键词：紫外光谱医药应用
前言:
紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的。

分子中价
电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级跃迁到高能级，此时电
子就吸收了相应波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外吸收光谱目前使用的紫外光谱仪波长范围是200~800nm.其基本原理
是用不同波长的近紫外光(200~400nm)依次照一定浓度的被测样品
溶液时,就会发现部分波长的光被吸收。

如果以波长λ为横坐标(单
位nm),吸收度(absorbance)A为纵坐标作图,即得到紫外光谱近年来,紫外光谱法已成为中药分析研究中主要的仪器分析法之一[1～4],从原始光谱鉴别发展到导数光谱、多波长光谱鉴别,从单一药材或纯组分分析拓展到复方组分分析。

紫外光谱在中药方面应用越来越广，下面介绍几例利用紫外光谱的研究。

一．紫外光谱研究中药大黄有效成分与牛血清白蛋白的相互作用
中药大黄的药理作用非常广泛,具有泻下、健胃、抗菌、保肝、
强心、降压等三十多种功效。

其主要活性成分有大黄素(emodin)、大黄酸(rhein)、大黄酚(chrysophanol)、芦荟大黄素(aloe-emodin)和大黄素甲醚(emodin-monomethyl ether)[1]。

为了研究大黄类有效成分在体内的代谢、转运过程,开展其与血清蛋白的相互作用研究有重要意义。

本实验采用紫外光谱法对大黄素、大黄酸和大黄酚与牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)的相互作用进行了研究,并对结合机制进行了探讨,获得了满意的测量灵敏度,为药物与蛋白质的相互作用研究提供了一种快速、简便、可行的方法。

大黄素、大黄酸和大黄酚均难溶于中性水溶液,但均溶于乙腈。

故实验采用含20%乙腈的硼砂(0.025 mol/L)缓冲液,pH9.24。

对缓冲液从200~700 nm进行吸收光谱的扫描,以去离子水作参比,波长范围内无明显吸收。

各物质浓度见表1。

混合液在室温下混合均匀,放置过夜以保证结合反应已完全平衡。

在BSA浓度是唯一可变参数的条件下,通过测量药物从200~700 nm的峰值吸收变化反映药物与BSA的相互作用。

实验采用紫外光谱法实现了对大黄素、大黄酸和大黄酚与BSA结合常数的测定,分别为K=1.47@105,K=5.00@105,K=1.18@104。

大黄酸和大黄酚与BSA相互作用的研究笔者尚未见文献报道,大黄素与BSA 相互作用的结合常数与文献值较一致,表明该方法准确可行,是药物与蛋白质相互作用研究中较易实现的方法,而且也拓展了紫外可见光谱法的应用。

进一步对大黄类有效成分与蛋白质结合的机制进行了探讨,大黄类有效成分与BSA的结合能力随其所含极性基团的增多而增
强。

用紫外光谱法研究中草药有效成分与血清蛋白质的相互作用时,中草药有效成分具有较大的摩尔吸光系数,与生命分子结合后这种具有较大摩尔吸光系数的组分会出现可被仪器正确识别的吸光下降。

因此可用紫外光谱法研究中草药有效成分与生命分子的相互作用,这不仅拓展了紫外可见光谱法的应用,也打破了不易使用其他仪器方法开展相互作用研究的局限性。

二．紫外光谱在天然产物结构鉴定中的应用
黄酮类、蒽醌衍生物、皂甙以及香豆素类化合物广泛分布于植物药中,它们的药理作用多种多样,其结构类型也是多种多样根据理论
和实践,对应用紫外光谱,区别上述天然产物的结构类型以及判断取
代基位置和数目,简单做一综述。

1.黄酮类
黄酮类化合物属于一个完整的共轭体系,在无水甲醇中的紫外光
谱有两个主要吸收峰,Ⅰ峰是由黄酮基本结构中的B环和丙酰侧链(即桂皮酰系统)引起的,Ⅱ峰是由A环和侧链(即苯甲酰系统)引起的,各类黄酮因基本母核的差异,使带Ⅰ和带Ⅱ的吸收强度有明显的差异,根据带Ⅰ和带Ⅱ的位置和强度,可大致区别黄酮的种类。

黄酮母核上
最常见的取代基是羟基,在特定的位置,可与三氯化铝或硼酸络合,引起相应的吸收带红移,不稳定的络合物,加盐酸后解离,使红移消失,据此,可推测出羟基取代的的位置和数目。

甲醇钠和醋酸钠是两种碱性试剂,能使黄酮母核上的酚羟基解离,影响吸收峰红移;其中,醋酸钠碱性较弱,只影响酸性较强的酚羟基,据此,可判断羟基取代情况;如果存在对碱敏感的体系(特定位置的羟基取代),容易在碱性条件下氧化破坏,光谱图上的吸收峰随处理时间延长而衰退。

在实际测定工作中,先测定样品“无水甲醇”光谱,然后加入适当的试剂,通过吸收峰的红移与结构之间的规律性,进行对比分析,能较快的推测出样品的大致结构,其主要判断规律如下
2.蒽醌衍生物
用乙醇作溶剂,蒽醌的苯样结构在紫外光谱上给出
252nm(lgE=4.7),325nm(lgE=3.7)的吸收峰,醌样结构给出
272nm(lgE=4.3)的吸收峰。

羟基蒽醌除引起上述吸收峰的变化,另外在230±10nm的范围内有一强吸收峰,在400nm以上,由羰基结构引起一吸收峰,所以羟基蒽醌有5个吸收谱带。

羟基蒽醌如只在A位上有羟基,苯样结构吸收峰的峰位红移,但强度降低;羟基蒽醌如只在B位上有羟基,苯样结构和醌样结构的吸收峰均红移、峰强度均增加。

这是由于A位或B位上连有羟基,相当于在苯环上加一助色团,必然引起苯样结构吸收峰的红移;当羟基连于B位上时,通过氧上孤对电子的转移,可与醌样结构形成一个稳定的共振系统,相当于增长了醌样结构的共轭链,所以能引起醌样结构吸收峰的红移和增色效应[5]。

无论羟基位于A或B位,羟基数目越多,红移越明显。

苯样结构给出的吸收峰(305—389nm)受供电子基影响,其规律是,当A位上有甲基、羟基、甲氧基时,峰位向红移动,但强度降低,而当取代基处于B位时,则吸收强度增高。

醌样结构中的羰基在可见光区可引起吸收,A—OH与羰基相互作用,极大地影响Kmax,A—OH数目越多,Kmax红移越大,其规律见表5
上类化合物,母体结构在紫外上有显著的特征吸收峰,取代基的存在及位置又影响吸收峰的位置,由此可获得结构信息。

在实际测定工
作中,加入适当的试剂,通过吸收峰的位移与结构之间的规律性,进行对比分析,能较快的推测出样品的大致结构,但其他天然产物如生物碱、糖苷、萜类、鞣质等能从紫外光谱上获得的结构信息就比较少。

三．紫外光谱在金属-蛋白的金属中心结构研究中应用的实例研究金属-蛋白的金属中心结构是探讨金属离子在体内的生理功能或毒理效应的基础。

许多金属-蛋白体系在紫外区均显示LMCT (ligand to metal charge transfer)型电荷转移谱带。

紫外区LMCT型谱带的吸收很强(消光系数通常在104mol-1左右),容易观察,特别适合于研究浓度较低的生化体系。

下面是我们用紫外光谱进行金属-血清白蛋白结构研究的几个实例,以证明这种光谱应用于金属-蛋白的金属中心结构研究的有效性。

1.紫外光谱测试
将金属离子溶液和HSA (human serum albumin,人血清白蛋白)或BSA (bovine serumalbumin,牛血清白蛋白)溶液按1÷1或n ÷1摩尔比混合,即得金属-血清白蛋白试样。

用相同条件下相同浓度的HSA或BSA溶液为参比,测定试样的紫外光谱,得到反映金属-血清白蛋白配合物金属中心结构信息的LMCT谱带。

2.紫外光谱特征及结论
① Cu(Ⅱ)-HSA、Cu(Ⅱ)-BSA和Ni(Ⅱ)-BSA体系
生理pH下,1÷1摩尔比的Cu(Ⅱ)-HSA、Cu(Ⅱ)-BSA和
Ni(Ⅱ)-BSA体系的LMCT谱带均由较低浓度时的三个峰转变为较
高浓度(大于2.5×10-4molõL-1)的一个峰(图2为Cu (Ⅱ)-BSA 的UV光谱)。

根据这一光谱特征并结合分子轨道理论,推断:这三种配合物的金属中心均位于白蛋白分子的N-端三肽段上,且均由较低浓度时五配位四方锥构型[M((Ⅱ) N4O,M=Cu、Ni]转变成较高浓度时的四方平面构型[M(Ⅱ)N4]。

根据这种体系的光谱数据, 利用前面的公式(1)计算,并讨论了Cu2+、Ni2+和有关配体轨道的光学电负性,第一次提供了HSA中A1sp羧基氧参与Cu(Ⅱ)配位的证据[3,4]。

在HSA或BSA的等离子点(分别是pH5.2和5.3)附近pH5.3处,上述三个体系的紫外光谱特征与生理pH的比较发生了较显著的变化(图略)。

我们推断: pH=4.0～5.3时,除Cu (Ⅱ) -HSA体系在低于4.0×10-4molõL-1时金属中心以五配位的四方锥[Cu(Ⅱ)N4O]构型存在外,Cu(Ⅱ)-BSA、Ni(Ⅱ)-BSA及浓度高于4.0×10-4molõL-1的Cu(Ⅱ)-HSA均以四方平面
[M(Ⅱ)N4]构型存在。

用pH效应可解释等离子点时与生理pH下金属中心结构的变化[5]
② Ni(Ⅱ)-HSA体系
根据紫外光谱和平衡透析的研究结果,我们首次报道生理pH
下Ni(Ⅱ)-HSA配合物中存在两个金属中心,且它们的LMCT谱带有接近100%的减色效应(hypochromism)。

第一个金属中心位于HSA的A1sp-Ala2-His3-肽段,随着Ni(Ⅱ)-HSA浓度的升高,该金属中心发生从6-D4h八面体(<1.4×10-4molõL-1)→C4v四方锥(1.4～2.3×10-4molõL-1)→4-D4h四方平面的构型转变;第二个
金属中心位于-Ala8-His9-Arg10-肽段上,在实验浓度范围内,它始终取4-D4h四方面平构型。

我们认为Ni (Ⅱ)-HSA体系的LMCT 谱带的减色效应是因这两个金属中心跃迁矩的偶极-偶极相互作用所致。

通过对这种减色效应进行初步的定量处理,发现LMCT跃迁也有基于偶极-偶极相互作用的减色效应,并且可以接近完全
参考文献
1．周永恰紫外光谱在金属-蛋白的金属中心结构研究中应用的若干实例* 1997.2
2．中国科学院上海药物研究所植物化学研究室编译.黄酮体化合物鉴定手册[M].北京:科学出版社,1981.496,649. 3．黄君礼,鲍治宇编著.紫外吸收光谱法及其应用[M].北京:
中国科学技术出版社,1992.74.
4．杨明河.薯蓣属植物中的甾体皂甙元[J].中草药1998.12 5．周永洽,胡绪英,车云霞,申泮文.化学学报, 1991,49: 59 6．周永洽,梁宏,郝韵琴,申泮文.无机化学学报, 1992,8(4): 382
7．郭珍，青海师范紫外光谱在天然产物结构鉴定中的应用8．何梅,夏之宁,阴永光,刘峥重庆大学化学化工学院紫外光谱研究中药大黄有效成分与牛血清白蛋白的相互作用。