DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告

DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告
实验目的：本实验旨在掌握用二苯胺法定量测定DNA含量的基本原理和方法。

实验原理：在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。

其中脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成ω-羟基-y-酮基戊糖，后者与二苯胺作用呈现蓝色，在595nm处有最大光吸收。

当样品DNA的含量在40-400µg范围时，光密度与DNA的浓度成正比。

样品中含有少量RNA不影响测定结果，但是蛋白质、脱氧核糖、阿拉伯糖和芳香醛等能与二苯胺形成各种各样有色物质，干扰结果。

在反应中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

试剂与仪器：DNA标准液、二苯胺试剂、样品溶液、试管与试管架、吸管与洗耳球、可见分光光度计。

DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定：取8支洁净干燥的试管，按表格操作。

混合后，于60度水浴中保温1小时，冷却至室温中，用分光光度计测定吸光值A595nm。

以DNA浓度为横坐标吸光值A595nm为纵坐标，绘制标准曲线，对照组标准曲线计算样品中DNA的含量。

实验结果与讨论：通过实验得出DNA标准曲线，
y=0.0098x，求出X1=40.71µg/ml，X2=39.39µg/ml，平均DNA 浓度为40.05µg/ml，含量n%=40.05/100%=40.05%。

注意：文章中的一些数字和符号可能需要根据实际情况进行调整。

分析：本实验使用标准曲线求得的DNA浓度为
40.05µg/ml。

在40-400µg范围内，光密度与DNA浓度成正比，因此使用标准曲线求得的浓度是准确的。

此外，DNA的标准
曲线线性关系的R2为0.9966，证明DNA光密度的关系密切，因此求出的浓度也比较精确。

然而，本实验测得的DNA含量
比整体水平偏低。

造成这种偏低的原因可能是以下几个方面：
1.在吸取DNA溶液样品时，未充分摇匀，便吸取
2.0mlDNA样液，造成DNA含量不均，从而导致实验存在误差。

此外，在加完试剂后，未摇动试管，直接放入60度水浴
保温，导致二苯胺与DNA的脱水物结合不充分，从而导致吸光值偏低，进而导致后续计算时样品DNA浓度偏低。

2.在进行分光光度测量时，比色皿可能没有充分洗涤，导致有少量自来水残留，相当于稀释了样品DNA浓度，使测得DNA吸光值偏低。

3.在吸取二苯胺试剂并分别加入8支试管时，由于采用了不同试瓶的二苯胺溶液，导致试剂间存在部分差异，从而影响DNA的脱水物结合情况，进而影响最终DNA吸光值的测定。

思考题：
1.如何判断样品中是否含有核酸？
取4支试管，按照以下表格操作（ml）：
管编号 1 2 3 4
样液 2.0 - 2.0 -
蒸馏水 - 2.0 - 2.0
地衣酚 - 2.0 2.0 -
二苯酚 2.0 - - 2.0
沸水浴中加热10min
观察试管内颜色变化。

如果第1支试管变蓝，第4支试管不变，则说明样品中含有DNA。

如果第3支试管变绿，第2
支试管无变化，则说明样品中含有RNA。

如果第2支和第3
支试管都不变绿，则说明样品中不含RNA。

如果样品中不含RNA，但第1支和第4支试管都不变蓝，则说明样品中不含DNA。

2.实验中加入乙醛的目的是什么？
加入乙醛的目的是使DNA发生交联，从而固定在细胞中，以便进行后续的实验操作。