细胞膜电穿孔现象机理研究

中国科学院电工研究所
硕士学位论文
细胞膜电穿孔现象机理研究
姓名：肖华娟
申请学位级别：硕士
专业：高电压与绝缘技术
指导教师：严萍
20040401
摘要
摘要
近年来，人们对电磁场产生的生物学效应及其应用的研究越来越广泛，包括电磁波的生物热效应和非热效应。

其中脉冲电磁场下非热生物效应是生物电磁学中最新的一个领域，普遍认为电磁脉冲非热效应的原发点为细胞膜，膜电穿孔是解释生物体中非热生物效应的关键。

电穿孔效应是指在适当的高压脉冲电场下，细胞或组织间起相对隔离作用的“屏障”内快速形成液态通道的现象，是电场与具有不同的介电常数而且易变形的物质相互作用的结果。

本文首先介绍电穿孔的机理及应用研究现状，并结合我们对细胞膜电穿孔基本特性的认识，设计制作了一台用于电穿孔研究用的新型脉冲电源，该电源具有双极性输出，其幅值、脉宽、重复频率及计数个数均可调节，文中对其系统结构及性能参数作了简要的介绍；论文中采用ＨｅｐＧ２细胞作为靶细胞，进行了电穿孔电场阈值的实验研究；结合试验研究和理论分析，建立了基于细胞膜电应力的电穿孔模型，对细胞膜电穿孔过程进行了详细的描述；此外对电穿孔研究中出现的细胞内电处理效应，我们对其机理进行了初步的探索。

关键词脉冲电场电穿孔电应力细胞内电处理
细胞膜电穿孔现象机理研究
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｉｎｔｈｅｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｈａｖｅｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｓｔｕｄｉｅｄｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｔｈｅｒｍａｌａｎｄｎｏｎ—ｔｈｅｒｍａｌｅｆｆｅｃｔｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｕｌｓｅｄｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄｉｓａｎｅｗｆｉｅｌｄｏｆｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ．Ｉｔｉｓｕｓｕａｌｌｙｂｅｌｉｅｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｒｉｇｉｎｏｆｎｏｎ—ｔｈｅｒｍａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｕｌｓｅｄｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄｉｓｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｔｈｅｅｌｅｅｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｉｓａｋｅｙｏｆｅｘｐｌａｉｎｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｎｏｎ．ｔｈｅｒｍａｌ．
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ＩＩ
引言
引言
生物电磁学（ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ）是研究从直流到远红外的电场、磁场和电磁场与生物系统相互作用的科学Ⅲ。

这是一门新兴的多学科交叉的边缘科学，还远未成熟和完善。

生物电磁学研究的主要内容【２】：一方面研究生物活体特别是人体自身的电磁过程及其与生命活动的关系和宏观表现形式。

另一方面，研究外界电磁场对生物活体的影响，发现外界电磁场对生物系统的各种生物学效应，以达到利用其正效应避免负效应，服务于人类健康的目的。

目前为止，人们对生物体自身的电磁信号进行了广泛的研究，对生物活体电信号的记录与处理分析已具有相当的广度和深度，其成果己广泛的应用于生物医学领域，如心电图和脑电图的获取分析已在疾病诊断方面起着举足轻重的地位。

近年来由于人工电磁场技术在功率、频率、波形及调制方式上的发展，电磁场对生物体的影响日益成为热门的研究课题，空间的深广程度和时间的复杂多变都给这一课题增加了许多挑战和难度。

生物系统对电磁场所产生的与生命现象有关的响应称为电磁场的生物学效应，通常可将其划分为热效应和非热效应【３１。

所谓电磁场的生物学热效应，是指一定频率和功率的电磁辐射照射在生物体上时，引起局部体温上升。

当温升超过组织调温能力，受照射组织内吸收的能量远大于生物体新陈代谢能量时，将引起生理和病理的变化。

还有一类叫生物非热效应，即是指电磁场通过使生物体温度升高的热作用以外的方式改变生理生化过程的效应。

在半个世纪的研究中，人们把大部分精力集中于生物热效应的研究，目前这方面的研究工作己基本完善。

美国已在新的非电离辐射防护标准中规定，人体对持续时间小于ｌＯＯｍｓ的单个电磁脉冲的比吸收量ＳＡＲ（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｒａｔｅ）要低于
２８．８Ｊ／ｋｇ，而射频辐射强度与机体组织内ＳＡＲ的关系可由实验和理论给出“１。

近２０年来，人们把研究目标集中于非热生物效应的研究上来，产生了多种机理并存的局面。

诸如粒子对细胞的穿透理论，生物系统中的相干振荡理论，自由基理论以及电磁干扰因子理论等…。

但由于生物体本身的复杂性及各种测量手段的缺乏，不同作者提供的实验结果往往不一致，难以比较，有些实验得不到重复，对非热效应的研究存在很大的分歧和争议。

细胞膜电穿孔现象机理研究
脉冲电磁场的非热生物效应是生物电磁学中最新的一个研究领域。

随着高压输配电系统的发展及电力电子设备的广泛应用，在电流开关过程中产生的脉冲电磁环境逐渐增加，另外核致电磁脉冲、短暂的激光束和电磁导弹、雷达发射场、以及大量的雷电电磁脉冲、高能电磁学和散射试验领域都会产生大量电磁脉冲，可以说人们无时无刻不处在各种脉冲电磁场的包围中，人类的生存环境变得越来越复杂。

经过大量的试验研究，目前形成共识的是脉冲电场对生物体的影响的最重要的方面是对细胞的影响，因为细胞是生物组织的基本结构和功能单元，人们推断非热效应原位点应该在细胞膜上，普遍认为脉冲电场的细胞膜电穿孔是解释生物非热效应机理的关键州。

一方面为了避免脉冲电场对生物体造成有害影响，另一方面为了更好的利用脉冲电场对细胞功能进行控制，近１０多年来人们对电穿孔的机理和应用进行了大量的研究，取得了一定的成果，电穿孔技术作为成熟的技术已广泛应用于基因工程、生物医学工程及工业食物灭菌等领域。

但总体看来，人们对电穿孔技术的实验研究和临床应用远远领先于机理研究。

目前电穿孔的研究主要存在以下不足：（１）电穿孔机理仍然不很明确，目前的模型都没有充分考虑细胞膜磷脂分子结构对电穿孔的影响，电穿孔分子作用机制及特性仍未被人们认识，这方面的研究还有待进一步深入；（２）电穿孔试验所用的电穿孔仪在功能上不够完善，提供的电场形式比较单一。

本文的目的在于通过脉冲电源的研制，为细胞膜电穿孑Ｌ实验研究提供功能齐全的脉冲电源：再者通过特定细胞电穿孔的试验研究，确定该细胞电穿孔所对应的电场闽值，建立细胞膜电穿孔模型，揭示细胞膜电穿孔的分子作用机制。

论文分五章，第一章主要介绍电穿孔现象及其机理研究和应用研究的进展：第二章介绍我们研制的电穿孔用新型脉冲电源：第三章主要介绍ＨｅｐＧ２细胞电穿孔和死亡率与电脉冲参数的关系，得出了ＨｅｐＧ２细胞电穿孔所对应的电场阈值；第四章通过理论分析，建立了电穿孔模型；第五章介绍了细胞内电处理的概念及其研究进展，并初步探讨了细胞内电处理机理；第六章作为本论文的总结，并提出存在的问题及对未来的展望。

第一章细胞膜电穿孔现象及其研究进展
Ｉ．Ｉ电穿孔现象
１．１．１细胞膜结构
细胞膜的结构非常复杂，主要是由脂质和蛋白质两类物质组成的复杂的超分子动
态系统。

１９７２年Ｓｉｎｇｅｒ和Ｎｉｃｏｌｓｏｎ提出的液态镶嵌模型【７】，目前己得到人们的承认。

液态镶嵌模型认为细胞膜是一种可流动的、嵌有蛋白质的脂类双分子层结构。

嵌入其
中的蛋白质具有多种功能，如离子通道、受体、及各种酶等。

构成细胞膜的脂类主要
有甘油磷脂、鞘磷脂、类固醇和糖脂，如图１—１所示。

这些脂类除了类固醇外，都有
亲水的极性的头部和疏水的非极性的尾部。

脂类分子极性头部向外，疏水的尾部在内，
构成细胞膜的基质——脂双分子层。

１．１．２电穿孔现象
图１－１细胞膜液态镶嵌模型
在正常的生理机能状况下，细胞膜能较好的阻碍离子和亲水分子的传输。

但是，
当施加强度为ＫＶ／ｃｍ、持续时间为ｐｓ—ｍｓ级的电脉冲刺激于细胞膜时，细胞膜会出
现微孔，同时电导率发生改变，暂时丧失屏障功能，从而引起离子的流出，代谢物的
排泄，细胞对药剂及ＤＮＡ等大分子的吸收量增加，这就是细胞膜电穿孔现象‘引。

电
脉冲造成的细胞膜的电穿孔存在两种形式：
可逆电穿孔和不可逆电穿孔。

其区别就在
于前者可在短暂时间内恢复、而后者则不能恢复或者是恢复较慢ｐ１。

图１．２形象的表明了细胞膜可逆电穿孔现象。

电穿孔现象是一种生物物理现象，可用于各类生物细胞，具有效率高，无残余毒性，参数易于控制等优点。

目前，这一技术已广泛应用于多个领域，如医学工程、遗传工程等。

尽管如此，但是电穿孔的机理仍然相当模糊。

图１．２细胞可逆电穿孔现象示意图
１．２电穿孑Ｌ机理研究进展
电对生物体的影响和作用早在两个世纪前已受到人们的重视和研究。

绝大部分工作重在应用电场对生物体的不可逆损伤和破坏性能，来进行食物的灭菌、病毒的灭活、脂肪的提炼等。

由这些早期的工作可知，高强度的直流、交流、脉冲电场均能破坏生物反应，杀死细胞。

但电场的这种致死效应实际上包含了电场、电流、热、电解等的综合影响。

电场对细胞完全可逆、无热效应的影响，在４０年ｆ｜ｊ己开始为人所知。

例如：细胞在非均匀交变电场中成串排列、细胞在交变电场中旋转等。

但是，电场对可兴奋性细胞的影响真正受到重视，则是在１９７３年Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ【ｌｏ】等人发现电脉冲可造成细胞膜的通透性瞬时增加之后。

经过进一步的研究，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ等人在ｌ９７４年【“１将细胞膜在电脉冲下的通透性瞬时增加和膜电阻瞬时下降的现象，定义为细胞膜的可逆电穿孔。

并发现诱导膜可逆电穿孔的脉冲宽度在ｕｓ—ｍｓ量级，穿孔后细胞膜可在短时问内恢复正常，该修复时阳Ｊ与细胞膜的组分和外界温度有关。

例如，在３７０Ｃ电穿孔的质膜可在数秒内恢复正常；而在４０Ｃ时，该恢复时间可达数十分钟、甚至数小时。

当外界脉冲电场过强时（脉冲幅度过高、宽度过长、脉冲数过多等），可造成膜的不可逆电穿孔，导致细胞膜永久损坏。

有关细胞膜电穿孔的研究，始于２０世纪７０年代，Ｓｅｎｄａ首次提供了植物原生质体电融合的形态证据，１９７９年首次实现了细胞电融合‘１２１，１９８２年又成功地应用于质粒的导入，实现细胞转化㈣。

七十年代末期，Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ、Ｔｓｏｎｇ等人的
细胞膜电穿孔现象及其研究进展
上。

由此可见，膜蛋白在可逆电穿孔中具有重要的功能。

而Ｓｏｗｅｒｓ在实验中观测到，电穿孔在膜上形成的孔道不能侧向移动、扩散，更进一步证实了蛋白质在电击穿及电融合中的作用【２钔。

Ｂｅｒｇ等人［２＿７】在１９８４年提出膜可逆电穿孔是电场诱导膜蛋白质极化和定向运动所致，但由于纯脂双分子层也存在可逆性电穿孔，故否定了该理论假说的广泛性。

有实验表明，电脉冲作用下膜蛋白发生构型的改变，因此可以认为蛋白质在电穿孔和电融合中具有一定的作用，特别是在电穿孔的稳定性方面具有重要作用。

根据Ｈ．Ｐ．Ｓｃｈｗａｎ啪３方程，置入电场Ｅ（ｔ）中的细胞达到静电平衡时，跨膜电压
ＡⅣ（ｆ）＝１．５Ｅ（ｔ）Ｒ。

ｔｔＣＯＳ０（１一１）其中艮。

是细胞半径，０是外加电场Ｅ（ｔ）与细胞膜被测点法向量之间的夹角。

因此当脉冲电场强度Ｅ（ｔ）较小时，跨膜电压刚达到临界击穿电压，细胞膜发生可逆电穿孔。

否则，跨膜电压大于临界击穿电压，细胞膜将出现大面积穿孑Ｌ，这种情况往往导致膜的不可修复，细胞膜发生不可逆穿孔。

但是，最近的研究表明，不可逆电穿孔和可逆电穿孔在一定程度上是相对的，在一定条件下可以相互转化。

例如：在电脉冲造成的人红细胞溶血试验中，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ等人【２９】都发现，外界溶液中若加入分子直径较大的分子（甘露醇、蔗糖、五糖）可有效的减轻或避免溶血，从而避免红细胞的永久破坏。

ＲｉｃｈａｒｄＨｅｒｚｏｇ等人【３０】在细胞的电融合中也发现，细胞悬浮液中加入大分子的聚蔗糖Ｆｉｃｏｉｉ可明显减少细胞的死亡和破坏。

由此可见，若电脉冲造成细胞膜较大面积穿孔时，由于细胞膜恢复较慢，若外界溶液能阻止胞内物质的外泄，则可保持细胞的活力，使细胞膜慢慢恢复正常。

反之则可导致细胞的不可逆损坏。

此外，温度在细胞膜的恢复中有很大影响，较高的温度也可促使细胞膜的迅速恢复。

１．２．１ＪａｍｅｓＷｅａｖｅｒ的亲水孔模型
对于细胞膜的可逆电穿孔，众多的理论模型都没有对穿孔过程进行系统描述，只有ＪａｍｅｓＷｅａｖｅｒ建立的瞬态亲水孔模型ｆ３“，对电穿孔过程进行了宏观描述。

ＪａｍｅｓＷｅａｖｅｒ计算出跨膜电位的增加会导致微孔半径的增大，当微孔半径大于临界值时，细胞膜会趋于破裂。

细胞膜是液态镶嵌模型，膜结构不是静态的，而是动态的。

除了膜中镶嵌的蛋白质外，由于热波动作用在细胞膜内也存在大量随机微孔。

这些微孔的存在不需要足够的跨膜电势，大小为几个埃，内表面为碳氢化合物疏水的尾部，因此通常情况下离子不能通过，是疏水孔。

当电场作用于细胞时，提高的跨膜电势使原初
细胞膜电穿孔现象机理研究
的细胞膜孔扩张。

一旦孔尺寸超过临界半径，疏水孔向亲水孔转变，这个转变所需能量是跨膜电势的函数。

亲水孔内表面的亲水性使得离子甚至大分子通过成为可能。

由于静电斥力，被输送的分子及粘附于细胞的细胞内分子进入孔可以阻止孔收缩，使孔存在更长时间。

如果电穿孔可逆，当电脉冲撤销后亲水孔向疏水孔转变。

细胞膜磷脂中瞬态亲水孔被认为是初级孔洞，这些孔洞控制着细胞膜的电行为及分子输送，其直径大约为ｎｍ数量级。

由于微孔尺寸小，而且状态不稳定，人们无法用现有的显微镜对微孔进行观察，只能通过离子和分子输送的特性来推断微孔的结构。

在红血球膜上看到的较大孔为次级孔。

这种孔较大，在细胞膜电击穿放电后长时间出现，可能是初级孔在压力的驱动下逐渐扩大而形成。

亲水孔模型认为电穿孔只是形成控制膜电特性的初级孔，在电场作用及细胞膜扩散系数和电导率的改变的共同作用下，初级孔向更大次级孔转变。

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图１－４疏水孔到亲水孔转变的过程示意图
图ｌ－４简单描绘了从疏水孔到亲水孔转变的过程。

图中，（Ａ）自由空间的起伏；（Ｂ）液水状的凸凹结构；（Ｃ）疏水通道的形成；（Ｄ）亲水通道（也被称为初级通道），离子和分子可以通过这个通道：（Ｅ）混合式的通道，在通道内边镶嵌着一个或多个蛋白质；（Ｆ）以亲水通道为主的混合式通道，带电的大分子镶入这个亲水通道。

细胞膜表面随机产生的微孔是电场能量和热运动能量共同作用而成的。

热运动的能量是随机的，它与温度的涨落有关：电场能量是可以控制的，直接与细胞膜跨膜电位相关，对细胞膜表面亲水孔的形成起决定性作用。

当增加跨膜电位时，微孔模型结构发生变化有两种可能：１）Ａ—Ｂ—Ｃ；２）Ａ—Ｂ—Ｄ。

实验证明，疏水孔存在时间短，亲水微孔的存在时间相对较长（＞１ｓ）。

ＪａｍｅｓＷｅａｖｅｒ的亲水孔模型成功的解释了膜蛋白在电穿孔中的作用，而且也解释了试验中所观察到的细胞膜长时间融合现象及孔的长时间存在的现象，对理解细胞
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细胞膜电穿孔现象及其研究进展
膜的电行为（电压、电导、膜电容）、机械行为（膜的复原与穿孔）及分子输送（通过膜的分子数）等都作了定性的描述。

尽管如此，瞬态亲水孔理论不能说明细胞膜电穿孑Ｌ的分子机制。

１．３电穿孔技术的应用研究
利用可逆电击穿在膜上形成的暂时性微孔，人们可以将各种外源物质（蛋白质、ＤＮＡ片段等）送入细胞，而又不导致细胞膜永久的损坏，这就是电穿孔技术。

目前，电穿孔技术已广泛用于生物技术，基因工程，临床医学等许多领域。

利用电穿孔可实现基因转染，细胞融合，以及将外源蛋白质分子插入细胞膜或导入细胞，激活细胞膜的传输因子，提高酶的活性，并可提高药物进入细胞的能力，增强癌症的化疗效果。

总结电穿孔现象应用研究现状，可知电穿孔有下列方面的应用口１】：
（１）通过把质粒或外来基因导入细胞实现基因转染；
（２）实现细胞融合，为异核体和杂交胚胎做准备：
（３）把蛋白质嵌入细胞膜；
“）提高药物进入细胞的能力，从而提高化疗治疗癌变细胞的效率；
（５）经皮给药等。

Ｉ．３．１ＤＮＡ的电转染
将ＤＮＡ电转染进入活细胞以改善活细胞的特性，这是目前电穿孔特性较广泛应用的领域。

胸（腺嘧啶脱氧核）苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ）简称廿（基因，Ｗｏｎｇ和Ｎｅｕｍａｒｍ等人通过电穿孔方法，率先成功地将ｔｌ【基因转移到培养小鼠的Ｌ一细胞（ｔＩ【基因有缺陷）中，并且证实了被转移基因的表达ｆ３２Ｊ。

１．３．２电穿孔促进细胞融合
细胞融合就是将多个细胞合并形成一个细胞，也称为细胞杂交。

细胞问ＤＮＡ的交换可以通过电融合来实现。

这个效应基于电场导致电偶极子的形成。

在非均匀场中，电偶极子的形成导致细胞线性平移（电泳），从而形成细胞链。

通过细胞在相互接触的部位电穿孔来进行遗传物质的交换。

电融合主要用在动物及植物育种使得不同的基因组结合在一起，从而产生新的物种，且可以产生人类单克隆抗体用于癌症治疗‘３３１。

细胞膜电穿孔现象机理研究
１．３．３细胞膜蛋白质的电导入
通过脉冲场的作用，可以将复制后的细胞膜蛋白质导入细胞膜。

Ｍｏｕｎｅｉｍｎｅ等‘３４】采用此项技术，将人的血型糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ）导入老鼠的红细胞膜，再将重组后的ＣＤ４受体导入人和鼠的红细胞。

电导入除了应用于临床，还能有效地应用于膜蛋白质与细胞膜的重组，该方法为细胞膜生物化学特性的研究开创了美好的前景。

１．３．４电穿孔促进药物的运送
近年来，Ｍｉｒ等人【３５】在对癌组织的化疗过程中，利用电穿孔特性提高化疗药物如博来霉素ｆｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）渗入肿瘤细胞的数量，药物毒性增加了６５００００倍，大大加强了ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ对癌细胞的杀伤力。

在国内，肿瘤的电穿孔疗法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙ，ＥＰＴ）逐渐引起了人们的注意，基金委曾支持重庆大学进行陡脉冲电场对恶性肿瘤杀伤效应和抑制作用的机理研究，探索陡脉冲电场对动物活体恶性肿瘤的不可逆性电穿孔过程和治疗的最佳剂量，为临床实验提供了理论基础和参考数据【３６】。

实验发现：在电穿孔状态下，ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ抑制了实验小鼠肿瘤组织的增长，最终导致肿瘤完全消失。

１．３．５经皮给药
经皮给药的电穿孔技术就是用高短脉冲作用在皮肤上，使皮肤产生可逆性孔道，药物在这段时间内通过该孔道进入到皮下，以促进药物的经皮渗透速率。

ＪａｍｅｓＷｅａｖｅｒ早在１９９７年使用ＤＮＡ导入仪作为皮肤电穿孔仪器进行经皮给药试验，发现电穿孔法要比离子导入法在药物的经皮渗透速度上提高５～１０倍【３７１，取得令人鼓舞的结果。

经皮给药是近年来发展起来的新的给药方法，具有可观的ｌ｜缶床应用前景。

１．４本论文研究内容
当前电穿孔研究中存在的问题主要有：（１）电穿孔用脉冲电源功能不够齐全，脉冲形式较单一，而且参数的调节范围较小。

（２）对电穿孔现象本质的认识不够清晰，电穿孔过程中分子作用机制不够明了。

因此，本论文的研究内容主要包括如下几个方面：
（１）电穿孔实验研究用新型脉冲电源的研制，．为电穿孔试验提供功能齐全、脉冲参数大范围调节的试验装置；
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细胞膜电穿孔现象及其研究进展
（２）通过细胞膜电穿孔实验研究，找出特定细胞膜电穿孔电场阈值；
（３）通过实验及理论分析计算，建立细胞膜电穿孔模型；
（４）通过理论计算仿真，对ｎｓ级脉冲下细胞内电处理机理进行初步探讨。

所有这些分析研究，都可以用以指导电穿孔协议，使电穿孔技术更好的应用于生物工程和医疗等领域。

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细胞膜电穿孔现象机理研究
第二章用于电穿孔试验研究的脉冲电源的研制
虽然电穿孔机理还没有被全面认识，但电穿孔技术作为己成熟的技术广泛应用于各种质粒的细胞转染，包括ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白质、药物、抗体、荧光探针等。

与其它质粒转染方式不同，细胞电穿孔的主要特点在于它是一种物理现象，可以应用于各种细胞，而且电穿孔操作对靶细胞影响小，从而保持了活细胞正常的生理条件。

所有这些特点使得电穿孔技术展现出好的应用前景。

电穿孔技术应用的关键在于提供高效、可靠及功能齐全的电源系统。

本章基于电穿孔生物效应试验研究和应用研究的特点，进行电穿孔用脉冲电源的研制，用于电穿孔试验及应用研究。

２．１电穿孔用电源的特点
细胞膜电穿孔试验所用的脉冲，矩形脉冲优于指数衰减脉冲，为了方便电穿孔的试验研究，要求矩形脉冲电源满足一定的技术指标。

由于生物个体的差异性及电穿孔影响因素的多样性，电穿孔用矩形脉冲电源应具有以下特点：①脉冲电源应具有较宽的脉冲幅值调节能力。

由前几章的分析可以看出，跨膜电势对电穿孔有决定性影响，
而跨膜电势与外电场场强幅值密切相关。

低于一定幅值的电脉冲不能引起细胞膜电穿
：
孔或者电穿孔效率较低。

根据样品池中电极的物理间距及生物细胞半径的不同，脉冲电源输出电压幅值可能是几百到几千伏。

②电穿孔效率及细胞存活率也受到脉冲宽度ｔ的影响。

使用很窄的脉冲宽度时，要达到有效的电穿孔效率所需的脉冲幅度通常很高。

反之，当脉冲宽度大时，所需场强较低。

因此，场强和脉宽对细胞的影响是一综合效果。

为了研究脉冲宽度与穿孔率之间的关系，脉冲电源应具有较宽的脉冲宽度调节能力。

③处在脉冲电场中细胞，细胞膜上承受两种电压：外电场引起跨膜电压及静息跨膜电压。

有人认为，外电场所致跨膜电势与膜固有的静息电势相叠加共同作用产生细胞电穿孔，但这种看法没有得到公认，是急待证实的问题，因此电穿孔用脉冲电源应输出正负极性脉冲并能进行脉冲个数的设置。

综上所述，实现细胞电穿孔的关键是能提供可靠的高压脉冲。

电穿孔所用矩形脉冲电源脉冲幅度及宽度必须在一定范围内连续可调，脉冲极性及个数均可设置。

而目前国内电穿孔仪多为电容放电脉冲，幅值和脉宽调节范围都较小，通常只有正脉冲。

国外电穿孔仪绿细胞波公司电穿孔仪脉宽及幅值调节能力强，但也只有正电压，不利
０。