检测锌离子的荧光探针

检测锌离子的荧光探针
一 Zn2+荧光探针简介
锌是一种重要的人体必需的微量元素(日需要量10-15 mg)，广泛分布于人体的细胞和体液中。

Zn2+是人体内200多种酶的组成成分，直接参与体内细胞生长、发育、生殖、组织修复等各种生命代谢过程。

Zn2+在细胞的生命活动中起着非常重要的作用，在基因转录、神经传递中都必须有Zn2+的参加。

若缺少了Zn2+的参与，会导致免疫系统受损、免疫功能缺陷等疾病的产生。

随着人们对锌在生命活动中作用的认识越来越深，Zn2+的检测也成为近些年来最受关注的研究。

其中Zn2+荧光探针法是目前最常用的一种方法，其主要特点是选择性好、灵敏度高、简便快捷。

一个可靠的Zn2+荧光分子探针应具有以下性质：光化学稳定性、强的抗干扰性、良好的水溶性、对Zn2+的敏感性等。

为了在生物体系中检测Zn2+，还必须考虑其它方面的因素，如激发光对生物活体的损伤、荧光分子探针在生物体外和生物体内的溶解性和细胞穿透性等。

此外，pH不敏感性也是需要考虑的一个重要因素。

Zn2+荧光分子探针的设计原理主要是基于光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、能量共振转移（FRET）以及激发态分子内质子转移等。

本文将按荧光团和配体分类，介绍基于不同设计原理的Zn2+荧光分子探针。

二Zn2+荧光探针分类
近年来，人们开始研究测定细胞内Zn2+的方法和技术，先后建立和发展了多种方法，如离子选择电极法以及利用金属显色指示剂的分光光度法，但这些方法存在干扰离子较多，灵敏度低等缺点。

荧光法以其选择性好、灵敏度高、简便快捷和可以追踪等特点一直为人们所关注。

目前，测定游离Zn2+的荧光探针主要分为以下几大类:
2.1卟啉类荧光探针
卟啉环是由十八个电子组成的大共轭体系，金属卟啉是卟啉核中心的两个氢原子被金属取代而形成的配合物，闭壳金属卟啉通常有荧光，卟啉的基本骨架结
构如图所示。

Zn2+与四-(3-间氯苯基)-卟啉和非水溶性四-(4-对氯苯基)-卟啉在pH6.0-8.0时可以形成稳定的荧光配合物，其激发波长为370nm，发射波长为510nm；二者检出限为3.5ug/L。

卟啉配合物适合于检测自来水中的Zn2+。

2.2 喹啉类荧光探针
常见类型包括氨基喹啉和羧基喹啉及其衍生物类。

使用最广泛的类型是以8-氨基喹啉和8-羟基喹啉为基体，依据所带基团的不同可分为以下类。

2.2.1 TSQ类
TSQ类是目前应用较为广泛的一类，主要是利用6-甲氧基
-(8-p-甲苯磺酰胺)-喹啉(TSQ)能与Zn2+结合形成荧光配合物的性质，在此基础上取代其中的某些基团形成新的化合物后再与锌配位。

这些方法的检出限一般都优于火焰原子吸收法，适于检测nmol级的Zn2+。

TSQ和Zn2+结合后激发和发射波长分别位于380nm和495nm，荧光强度增强100倍，但TSQ-Zn2+络合物的结构和稳定常数不确定，并且络合物的荧光强度在不同介质中变化较大，而且其在紫外光的照射下才能发出荧光，对活体细胞有伤害；同时膜透性低，在定量测定游离锌离子浓度方面还存在一定的难度，因而阻碍了这一类荧光试剂在活体细胞内的应用。

2.2.2 喹啉磺酸类
8-苯磺酰胺基-喹啉(BSQ)作为一种鳌合树脂应用于流式细胞或用流动注射法检测细胞内的Zn2+或Cd2+，该配位试剂形成后就固定在细胞内。

其缺点不能有效的区分Zn2+、Cd2+。

8-(5’-二甲氨基-1’-奈酚)-磺酸氨基喹啉与锌形成配位荧光化合物，该配体的优点在于利用喹啉基团能发荧光和磺酸基团具有膜透性的特性，有效地将氨基喹啉、丹酰基团结合起来。

因为其光谱在近可见光区，所以具有对活体细胞危害小的特点，在EDTA、EGTA与8-(5’-二甲氨基-1’-奈酚)
磺酸氨基喹啉同时应用时并不影响其与Zn2+配位，能有效的提高其
选择性，灵敏度高，是一个具有发展前景的荧光试剂。

2.2.3 低聚物类
总之，喹啉类荧光试剂检测Zn2+时，主要缺点是在紫外光区，不能应用于活体细胞的Zn2+检验；同时，检验的不一定是游离的Zn2+，有可能是从含锌蛋白中配位而来的。

2.3 荧光素类荧光探针
荧光素在水溶液中有很高的荧光量子产率，而且其激发波长在可见光区范围，因此可以作为Zn2+荧光探针分子的荧光团，一些探针在生物应用中得到了广泛的运用。

Zinpyr-x类荧光探针利用光诱导电子转移的机理来检测Zn2+，
Zinpyr-1是这类探针中的典型代表，是利用双(2-吡啶甲基)胺
与2，7-二氯荧光素结合形成的具有高亲和性、高选择性、良好的细胞渗透性的Zn2+荧光探针。

其结合Zn2+后荧光强度增大3倍，且随pH变化而变化，pH 5.5
时荧光强度最大，pH>12时荧光消失。

其激发波长和发射波长分别为507nm和525nm。

Znpyr-1能在可见光下发出荧光，同时很好地与488nm的氩离子激光线重叠，这一性质将推进这种探针在激光共聚焦显微扫描技术中的应用。

但其缺点是背景荧光量子产率高(0.39)，并且在近中性条件下对pH敏感，以至于生物体受到刺激所引起的pH变化会干扰荧光强度的变化。

后来所报道的Zinpyr-2对H 质子的敏感性有所改善，但在活细胞中的应用有一定的局限性。

Zinbo-x类荧光探针由具有高荧光特性的苯并恶唑和各种不同Zn2+螯合团组合而成。

比例计量型Zn2+荧光探针Zinbo-5对Zn2+有较强的亲和力与高选择性。

Zinbo-5在结合Zn2+前其激发和发射波长分别为337nm和407nm，结合Zn2+离子后其激发和发射波长分别红移至376nm和443nm，伴随着荧光量子效率增加5倍。

随着Zn2+浓度的增加，荧光强度比例不断增大。

Zinbo-5可以用来探测纤维细胞内Zn2+浓度的改变。

2.4 肽和蛋白类荧光探针
相对于小分子荧光探针，近年也合成了一些基于肽和蛋白的大分子荧光探针。

例如，合成了结合两个荧光团的金属硫蛋白，其中荧光素作为能量给体、罗丹明作为能量受体。

这种肽测定Zn2+主要是基于两个荧光团之间的荧光共振能量转移。

在没有结合Zn2+之前，肽打开，两个荧光染料距离相对较远，分子内能量转移极弱；但是当Zn2+结合肽之后，肽折叠起来使两个染料距离拉近，增大了分子内的能量转移，提高了罗丹明的荧光强度。

此外，Walkup等设计出一种新的Zn2+荧光探针，其配体部分是Cys2/His2、荧光团是丹磺酰胺。

在pH为7.0的HEPES 缓冲溶液中，其最大发射波长是560nm，随着Zn2+的加入，发射波长蓝移475nm，荧光强度呈线性增大，并且Mg2+、Co2+等都不会干扰Zn2+的检测，但是因为分子中肽的存在，对任何金属引起的构型变化都很敏感，尤其是Cys2/His2非常容易被氧化，所以并不适合在一些包含了氧化剂的水溶液中存在。

因此，这种探针的应用受到了细胞中氧化还原环境的限制。

蛋白类的探针合成比肽类探针的合成要困难许多。

蛋白类传感器的合成方法有两种，一种是和碳酸酶(CA)结合在一起，另一种是基于绿荧光蛋白类(GFP)的传感器。

早在上世纪60年代，就将牛血红细胞CA和丹磺酰胺结合在一起，主要
是基于芳基磺酰胺可以抑制CA的活性。

尽管丹磺酰胺对Zn2+的结合能力一般，但是在结合Zn2+后会导致荧光大大增强，发射波长蓝移。

这种荧光特征不同于apoCA和自由的丹磺酰胺，因此结合了芳基磺酰胺荧光团的apoCA常用来对Zn2+进行荧光测定。

2.5 腙类荧光探针
腙类试剂结构为R1-CH=N-NH-R2，其中-CH=N-NH-是易流动的电子桥，它们与M n+配位时构成一个平面、刚性具有共轭体系的荧光特征结构。

水
杨醛甲酰腙在pH6.3的乙醇介质中与Zn2+生成1:1的荧光配合物可测定ug/L级的锌。

苯并吡唑-2-醛-喹啉腙(BAQH)为锌的荧光分析试剂，它与锌组成的化合物能产生强烈荧光可用于测定小于1ug/L的锌，由于其波谱范围在可见光区，可被应用于细胞中Zn2+的测定，因此具有较好的应用前景；水杨醛-5-溴-水杨酰腙(SABSH)在pH7.9的异丙醇/水(体积比1:1)溶液中与在Zn2+形成1:2(金属:试剂)的配合物，浓度低于400ug/L时线性关系好，检出限为1.3ug/L。

但上述方法都不同程度的存在抗外界干扰离子性差的缺点，主要用于测定生物样品如人发、面粉等的锌离子。

2.6氨羧类荧光探针
钙黄绿素蓝即4-甲基伞形酮-8-亚甲基亚氨基乙二酸在十六烷基三甲基溴化按(CTMAB)存在下与锌生成1:l的配合物，使钙黄绿素蓝的荧光增强，pH5.7-6.3范围内配合物的相对荧光强度最大且恒定，荧光稳定性保持两小时不变，检出限为1.70ug/L，与Ca2+、Mg2+的区分较好，但Cd2+ 、Hg2+ 、Cu2+等有干扰。

可用于测定脱脂奶粉、大米粉、含锌营养盐中的微量Zn2+。

2.7 其他荧光探针
还有一些探针，比如1，2，4-三羟基蒽醌在一定介质和pH条件下与Zn2+结合后能发出荧光。

其激发波长和发射波长分别为455nm和605nm，检出限为2．31ug/L。

此方法已经成功应用于检测药物制备中的Zn2+。

三各类型Zn2+荧光探针的比较
根据Zn2+荧光探针的激发和发射谱，把Zn2+荧光探针分为紫外激发，可见光激发，近红外激发和比例计量型四种类型，并对各类荧光探针的激发和发射特性，量子效率特性等进行了归纳总结与对比，为Zn2+荧光探针的实际应用提供参考。

紫外光激发的Zn2+荧光探针其发射波长都在可见光范围内，这给用肉眼直接观察实验发生提供了条件，避免了激发光对发射光的观察干扰，减小了外界光对实验的干扰，但紫外激发容易对生命细胞产生伤害，也会产生Zn2+动力学活动的假象，这在一定程度上也限制了其在生物体Zn2+检测上的应用。

可见光激发的Zn2+荧光探针，该类探针与紫外激发的荧光探针相比优点在于，当用于细胞Zn2+检测时，可见光大大降低了紫外光对细胞的毒性作用，有效减小了细胞自发荧光干扰，可被大多数有激光光源的仪器有效激发，可见光激发使实时测定细胞中的锌的可操作性增强，观察者不必顾忌紫外光对人眼的损害。

近红外Zn2+荧光探针有很好的应用前景，特别是在650nm到900nm的光学窗口下，该类荧光探针的激发光具有穿透皮肤和组织的能力，并只产生极小的自发荧光和低的背景光散射。

目前该类探针仅仅局限于用三碳菁染料作为荧光团。

比例计量型Zn2+荧光探针就是荧光探针与锌结合后激发或发射波长发生明显改变，通过测定Zn2+诱导的双发射(或激发)峰的比例变化可实现对Zn2+的定量检测。

由于探针分子的量子产率易受环境影响，而自由探针和结合Zn2+后的探针受环境影响相似，因此比例计量型荧光探针可以避免检测环境的影响，可实现对Zn2+动态变化过程高灵敏度的定量检测。

正是由于这一优点，寻找这类探针的研究工作已成为目前Zn2+荧光探针研究的热点。

四 Zn2+荧光探针的发展展望
从上世纪八十年代开始，许多锌荧光探针就已经开始合成了。

人类在应用荧光法测定游离的Zn2+方面已经取得了很大的进步，许多荧光探针展现了很好的选择性和亲和性，但是锌的这种特殊的螯合剂仅仅限于几种组分，如：喹啉，DPA 等等，因此发现和合成新的螯合剂已成为必然。

人们现在已经清楚的认识到在神经生理学中Zn2+是仅次于Ca2+的一种非常重要的元素，而基于荧光探针的生物体Zn2+检测以其选择性好，灵敏度高，成本低等特点无疑是最具潜力的定量测量方法，并且已经证明Zn2+的检测分辨率可以达到皮摩尔级。

可以预测，随着新型仪器设备、测定技术的发展和新型Zn2+荧光指示剂的合成，人们一定会对细胞内Zn2+的分布和作用有更清新、更全面的了解。

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