牛卵泡颗粒细胞中生长相关基因的表达研究

牛卵泡颗粒细胞中生长相关基因的表达研究
马丽珠; 郑宇新; 王立强; 江中良
【期刊名称】《《家畜生态学报》》
【年(卷),期】2019(040)009
【总页数】5页(P56-60)
【关键词】雌激素受体(Esrs); 卵泡发育; 颗粒细胞; 牛
【作者】马丽珠; 郑宇新; 王立强; 江中良
【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100
【正文语种】中文
【中图分类】S811.5
动物卵巢上卵泡生长与排卵受包括基因调控在内的多种因素影响。

在基因调控中，雌激素受体(Estrogen Receptors，Esrs，含Esr1和Esr2)在卵巢相关的生理与病理过程中都发挥着重要作用，而雌激素是通过调控其受体对卵泡发育起着重要的介导作用[1]。

研究表明，Esrs敲除的小鼠都存在有不同程度的卵巢功能缺陷[2-3]。

此外，在每个生殖周期中，卵泡发育和卵母细胞成熟主要受垂体促性腺激素(FSH 和LH)调控[4]，而LH刺激排卵前卵泡的减数分裂恢复和随后排卵，FSH则负责刺激下一批卵泡的生长发育[5]。

Cox2作为排卵诱导因子及细胞凋亡的抑制因子，可以被有丝分裂素、细胞因子、肿瘤启动子和生长因子等诱导[6]。

研究表明在大鼠中HSD17B1主要由FSH调控，并由卵泡中的性激素和生长因子调控。

FSH通
过蛋白激酶A依赖性途径在分离的大鼠颗粒细胞中刺激HSD17B1的表达[7]。

同时，雌激素和雄激素增强了FSH对HSD17B1表达和活性的刺激作用[8]。

尽管相关研究已经在小鼠、大鼠等动物及人类上有了一定的研究，但在牛上还少见报道。

本研究以牛卵泡颗粒细胞为对象，通过收集牛卵巢上不同直径的颗粒细胞，提取总RNA并检测牛卵泡颗粒细胞中Esr1、Esr2、Fshr、Lhr、Cox2和
Hsd17b1基因的相对表达，为探讨相关基因在牛卵泡发育及成熟中的作用提供数据支持，拟为牛卵泡发育的基因调控等基础研究提供理论参考。

1 材料与方法
1.1 卵巢来源
从屠宰场采集健康、成年的牛卵巢，置于37 ℃含1%青链霉素混合液的生理盐水中，无菌保温壶中带回实验室备用。

1.2 颗粒细胞的收集
将卵巢用75%的酒精杀菌消毒30s后，再用预热的生理盐水(37 ℃)冲洗3次，送入无菌操作台。

用手术剪剪下卵巢上直径分别为<2 mm、2～6 mm、>6 mm的健康卵泡(卵泡液清亮透明，卵泡膜略呈黄色，毛细血管分布均匀)并分别置于含细胞培养液的表面皿中。

室温条件下，将培养皿中的卵泡剪碎，150目筛网过滤所得颗粒细胞悬液5 min，1 000 rmp离心。

去上清液，向离心管中加入200 μL Trizol，充分震荡混匀，静置5 min后放入-70 ℃冰箱中保存。

1.3 颗粒细胞中总RNA的提取
采用RNAiso Plus试剂盒提取颗粒细胞中的总RNA并测定其纯度和浓度。

1.4 基因表达检测
1.4.1 去除基因组DNA反应配置去基因组DNA反应体系并加入RNA样品中，涡旋震荡后短暂5 min，42 ℃ 孵育2 min，反应结束后，置于冰上冷却。

1.4.2 RT-PCR反应配置RT-PCR反应体系，加入上一步骤的预混液中，混匀，
cDNA合成反应体系为：37 ℃孵育15 min，85 ℃ 孵育5 s，反应结束后，取出
放在4 ℃冰箱中保存、备用。

1.5 实时荧光定量PCR检测
1.5.1 引物设计与合成在Gene Bank上查出所检测基因的cDNA序列，采用Primer Express 3.0软件设计相应引物，并由上海Invitrogen公司合成。

牛卵巢
靶基因特异性引物及其序列如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR所用特异性引物及其序列Table 1 Specific primer sequences used for Real-Time PCR基因Genes上游引物 Forward primer下
游引物 Reverse primerH2AFZ5'-GAGGAGCTGAACAAGCTGTTG-3'5'-TTGTGGTGGCTCTCAGTCTTC-3'Esr15'-CCAACCAGTGCACGATTGAT-3'5'-TTCCGTATTCCGCCTTTCAT-3'Esr25'-CAGCCGTCAGTTCTGTATGCA-3'5'-TCCTTTTCAATGTCTCCCTGTTC-3'Fshr5'-AGCCCCTTGTCACAACTCTATGTC-
3'5'-GTTCCTCACCGTGAGGTAGATGT-3'Lhr5'-GCACAGCAAGGAGACCAAATAA-3'5'-TTGGGTAAGCAGAAACCATAGTCA-
3'Cox-25'-CTCTTCCTCCTGTGCCTGAT-3'5'-CTCTTCCTCCTGTGCCTGAT-
3'Hsd17b15'-TGTGGTACTCATTACCGGCTGT-3'5'-CAGCGTGGCATACACTTTGAA-3'
1.5.2 引物稀释将试验中用到的所有引物RNase-Free Water稀释到10 μM/mL。

1.5.3 荧光定量PCR检测利用SYBR Green l荧光指示剂，以合成cDNA为模板，H2AFZ为报告基因，在ABI 7500Real-Time PCR系统中检测颗粒细胞中基因的
相对表达。

反应体系为25 μL，热循环参数如下：93 ℃预处理5 min后，95 ℃变性15 s，59 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。

1.6 数据统计与分析
Real-Time PCR仪扩增后，得到的各个样品基因的Ct值，其中H2AFZ基因作为
内参基因，目的基因的表达变化通过2-ΔΔCt方法进行计算，并用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，差异显著性用One-Way ANOVA中的LSD法分析(P<0.05)，数据用Mean±SD表示。

2 结果与分析
2.1 牛卵泡颗粒细胞中Esr1与Esr2的表达
牛不同直径卵泡颗粒细胞中Esr1与Esr2的相对表达如图1所示。

图1 Esr1(左)和Esr2(右)在牛卵泡颗粒细胞中的相对表达上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

下同。

Fig.1 Relative expression of Esr1 (left) and Esr2 (right) in bovine ovarian granulosa cells The letters above the bar indicate significant difference(P<0.05).The same below.
由图1可知，随着卵泡的生长，Esr1基因在卵泡颗粒细胞中表达量逐渐降低，相对于小型卵泡颗粒细胞，大型卵泡颗粒细胞中Esr1的表达显著降低(P<0.05)；Esr2基因的相对表达量与Esr1相似。

本研究结果显示，随着卵泡的生长，Esr1、Esr2的表达逐渐减弱。

2.2 牛卵泡颗粒细胞中Fshr与Lhr的表达
由图2可以看出，随着卵泡的生长，Fshr在颗粒细胞中的表达量显著上升
(P<0.05)，且在中、大型卵泡颗粒细胞中的表达没有显著差异；Lhr在小型和中型卵泡颗粒细胞中的表达量相对较低，而在大型卵泡颗粒细胞中的表达量显著升高(P<0.01)，表明大卵泡是在为排卵做准备。

2.3 牛卵泡颗粒细胞中Cox2与Hsd17b1的表达
由图3可知，随着卵泡的生长，排卵诱导因子Cox2在卵泡颗粒细胞中表达量逐渐增高，相对于小型卵泡，大型卵泡颗粒细胞Cox2的表达量显著上升(P<0.05)，表明大卵泡中排卵诱导反应启动；然而，作为细胞凋亡的抑制因子，Hsd17b1基因的相对表达量是随着卵泡直径的增大而逐渐降低，大型卵泡颗粒细胞中表达量显著
降低(P<0.05)，表明Hsd17b1的表达对排卵没有影响。

图2 Fshr与Lhr在牛卵泡颗粒细胞中的相对表达Fig.2 Relative expression of Fshr and Lhr in bovine ovarian graunlosa cells
图3 Cox2 (左)和Hsd17b1(右)在不同直径牛卵泡颗粒细胞中的相对表达Fig.5 Relative expression of Cox2(left) and Hsd17b1 (right) in bovine ovarian granulosa cells
3 讨论
3.1 牛不同直径卵泡颗粒细胞中Esr1与Esr2的表达
在卵泡发育过程中，雌激素主要通过其受体Esrs(Esr1，Esr2)发挥作用，Esrs的两种亚型在卵泡细胞中的定位和表达量不尽相同。

雌激素促进颗粒细胞增殖和卵泡细胞的分化，并抑制小型有腔卵泡或腔前卵泡的闭锁，还能促进大卵泡的成熟[9]；
卵泡液中的雌激素水平与卵泡的健康程度呈正相关[10]，表明Esrs在卵泡发育中
有重要作用，但在牛卵泡颗粒细胞中的研究还未见报道。

本研究结果表明：Esr1
和Esr2基因在卵泡颗粒细胞中均有表达，其表达量都随着卵泡的生长而逐渐降低，该结果与Esrs基因在其他物种的表达相似。

丘彦等[11]通过染色切片研究表明，
在小鼠上，除了原始卵泡外，初级卵泡、次级卵泡及其余所有的腔卵泡的颗粒细胞中均有ERβ(即Esr2)表达，其表达量的高低顺序为：小有腔卵泡、大有腔卵泡、排卵前卵泡、腔前卵泡，这与本研究结果一致。

但在Esr1的表达上，丘彦等(2006年)的研究表明，小鼠所有类型卵泡颗粒细胞的ERα染色都为阴性，这可能是因为在小鼠上，ERα主要定位于卵泡内膜细胞上，而目前的研究结果表明，Esr1也可
见于颗粒细胞。

岳占碰等[12]的研究表明，在卵泡颗粒细胞中ERβ的表达量显著
多于ERα的表达量，但在目前的研究结果中，未发现两者有明显差异，同时，
Esr1和Esr2在不同直径卵泡颗粒细胞中的表达变化趋势一致。

3.2 牛不同直径卵泡颗粒细胞中Fshr与Lhr的表达
卵泡生长的标志之一是颗粒细胞的增殖，而颗粒细胞功能正常于卵泡发育的标志是Fshr的表达[13]。

有腔卵泡的生长主要依赖于促性腺激素(FSH，LH)，表明Fshr 与Lhr的表达至关重要。

目前的研究结果表明，Fshr在小、中、大型有腔卵泡的颗粒细胞中均有表达，且随着卵泡的生长而显著上升。

在卵泡发育初始阶段的颗粒细胞中，Fshr受FSH的刺激，促进颗粒细胞分泌雌激素，雌激素和FSH又共同促进颗粒细胞增殖分化；在卵泡“选择”之后，FSH浓度会下降，下降的原因是被选择的卵泡大量产生雌二醇，雌二醇反馈性抑制垂体中FSH的分泌，此时虽然FSH下降，但表达出更多Fshr的卵泡成为优势卵泡仍能接受FSH的刺激并促进颗粒细胞表达Lhr。

卵泡的发育由FSH依赖性转变为LH依赖。

其他研究也表明Lhr在小型和中性卵泡的颗粒细胞中表达量很低，而在大型卵泡的颗粒细胞中表达量明显升高[14-16]，与本试验结果一致。

3.3 牛不同直径卵泡颗粒细胞中Cox2与Hsd 17b1的表达
排卵诱导因子环氧化酶2(cyclooxygenase，Cox 2)是花生四烯酸合成前列腺素的关键酶，而前列腺素在诱导卵泡排卵、胚胎着床与发育过程中起重要作用[17]。

在Cox 2基因缺陷的雌性小鼠会出现多方面的生殖功能障碍，如排卵障碍、卵子受精率下降、胚胎着床及子宫蜕膜化障碍等[18-19]。

目前的研究结果表明，随着卵泡的生长，卵泡颗粒细胞Cox 2的表达量升高，表明Cox 2开始诱导卵泡排卵。

Hsd17b1以NADPH为辅助因子，对卵泡发育起着重要的调控作用。

Hsd17b1基因表达的上升，能够促进NADPH通过还原反应使雌激素活性低的雌醇(E1)转变为高活性状态的雌二醇(E2)，且其还原反应能力(E1转变为E2)是氧化反应能力(E2转变为E1)的23倍，胞内NADPH的浓度是NADP+的100倍[20-21]，对卵泡的生长具有重要的作用。

目前的研究结果表明，Hsd17b1基因在卵泡颗粒细胞中的表达是随着卵泡的生长而逐渐降低，相对于小、中型卵泡颗粒细胞中Hsd17b1的表达，大型卵泡颗粒细胞中表达量相对较低，表明Hsd17b1对卵泡排卵没有明
显影响。

Hsd17b1能够催化雄烯二酮(androstenedione，A4)转变为睾酮(testosterone,T)，作为雌激素生成的底物，诱导雌激素的增加，协同诱导卵泡发
育[22-23]。

另外，在Hsd17b1基因敲除小鼠上的最新研究表明，Hsd17b1缺乏，小鼠卵巢表现为卵泡黄体化受阻，孕酮分泌减少，颗粒细胞增大，小鼠繁殖力下降[24]。

因此，Hsd17b1基因在调节动物体内雌激素的生成、孕酮的分泌及促进动
物卵泡发育方面有着重要的作用，不影响排卵[25]。

4 结论
研究结果表明，牛卵泡颗粒细胞都能表达Esr1和Esr2，其表达量都随着卵泡的生长而下降，表明大卵泡对Esr1、Esr2的依赖逐渐减弱；Fshr、Lhr及Cox2的表
达随卵泡的生长而显著上升(Lhr尤为明显)而Hsd17b1表达量逐渐降低，表明卵
泡已启动排卵反应，准备排卵。

参考文献：
【相关文献】
[1] 田丽媛, 赵亚力, 韩为东. 雌激素受体在卵巢癌发生发展中作用的研究进展[J]. 国际妇产科学杂志, 2007(4):254-257.
[2] 雷忻, 张育辉, 李亚琳. 卵巢雌激素受体的研究进展[J]. 延安大学学报(自然科学版),2004,
23(3):73-76.
[3] 解佰纯, 杨增明. 两种雌激素受体亚型在雌性生殖系统中的不同调控作用[J]. 生殖与避孕, 2009,
29(5):309-313.
[4] RICHARDS JS. Maturation of ovarian follicles: actions and interactions of pituitary and ovarian hormones on follicular cell differentiation[J]. Physiol Rev,1980,60: 51-89.
[5] KUMAR T R, WANG Y, LU N, et al. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility[J]. Nat Genet,1997,15: 201-204.
[6] WILLIAMS C S, MANN M, DUBOIS R N. The role of cyclooxygenases in inflammation, cancer, and development[J]. Oncogene,1999,18:7 908-7 916.
[7] GHERSEVICH S, NOKELAINEN P, POUTANEN M, et al. Rat 17 beta-hydroxysteroid
dehydrogenase type 1: primary structure and regulation of enzyme expression in rat ovary by diethylstilbestrol and gonadotropins in vivo[J]. Endocrinology,1994a,135:1 477-1 487.
[8] GHERSEVICH S, POUTANEN M, TAPANAINEN J, et al. Hormonal regulation of rat 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in cultured rat granulosa cells: effects of recombinant follicle-stimulating hormone, estrogens, androgens, and epidermal growth factor[J]. Endocrinology，1994b,135:1 963-1 971.
[9] EMMEN J M, COUSE J F. In vitro growth and ovulation of follicles from ovaries of estrogen receptor (ERα and ERβ) null mice indicate a role for ERβ in follicular maturation [J]. Endocrinology,2005,146(6):2 817-2 826.
[10] 郭文艳, 丛晶, 吴效科. 类固醇激素在卵泡生长发育过程中的作用[J]. 世界中西医结合杂志, 2008, 3(2):120-122.
[11] 丘彦, 贺雪辉, 王炼炼. 性成熟小鼠卵巢和性未成熟小鼠体外培养卵泡的雌激素受体α、β亚型表达的研究[D].重庆：重庆医科大学, 2006.
[12] 岳占碰, 张学明, 马琳. 雌激素对哺乳动物卵泡发育的影响研究进展[J]. 中国畜牧杂志, 2007, 43(1):41-43.
[13] MA W，JING L，VALLADARES A，et al. Silver Nanoparticle Exposure Induced Mitochondrial Stress，Caspase-3 Activation and Cell Death:Amelioration by Sodium Selenite [J]. International Journal of Biological Sciences，2015，11(8):860-867.
[14] 文祥,祝诚,吴燕婉. LH受体mRN A在卵泡中的表达[J]. 动物学报, 1999,45(4):427-434.
[15] ABDENNEBI L, MONGET P, PISSELET C, et al. Comparative expression of luteinizing hormone and follicle stimulating hormone receptors in ovarian follicles from high and low prolific sheep breeds [J]. Biology of Reproduction, 1999,60(4):845.
[16] BAO B, GARVERICK H A, SMITH G W, et al. Changes in messenger ribonucleic acid encoding luteinizing hormone receptor, cytochrome P450-side chain cleavage, and aromatase are associated with recruitment and selection of bovine ovarian follicles[J]. Biology of Reproduction, 1997, 56(5):1 158-1 168.
[17] 冼英杰，陈彩蓉，周秀琴，等.促排卵药雷洛昔芬对小鼠着床窗期子宫内膜COX-2和LPAR3表达的影响[J].分子诊断与治疗杂志,2016,8(03):174-177.
[18] BLITEK A, MENDRZYCKA A U, BIEGANSKA M K, et al. Effect of steroids on basal and LH-stimulated prostaglandins F(2alpha) and E(2) release and cyclooxygenase-2 expression in cultured porcine endometrial stromal cells[J]. Reproductive Biology, 2007, 7(1):73. [19] DANNENBERG A J, ALTORKI N K, BOYLE J O, et al. Cyclo-oxygenase 2: a pharmacological target for the prevention of cancer[J]. Lancet Oncology, 2001, 2(9):544-551.
[20] ZHANG C Y，CHEN J，YIN D C，et al. The contribution of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 to the estradiol-estrone ratio in estrogen-sensitive breast cancer cells[J].PloS One，2012，7(1):e29835.
[21] GANGLOFF A, GARNEAU A, HUANG Y W, et al. Human oestrogenic 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase specificity: enzyme regulation through an NADPH-dependent substrate inhibition towards the highly specific oestrone reduction.[J]. Biochemical Journal, 2001, 356(1):269-276.
[22] SALONIEMI T, LAMMINEN T, HUHTINEN K, et al. Activation of androgens by hydroxysteroid (17beta) dehydrogenase 1 in vivo as a cause of prenatal masculinization and ovarian benign serous cystadenomas[J]. Molecular Endocrinology, 2007, 21(11):2 627-2 636.
[23] SALONIEMI T, WELSH M, LAMMINEN T, et al. Human HSD17B1 expression masculinizes transgenic female mice[J]. Molecular & Cellular Endocrinology, 2009, 301(1-2):163-168.
[24] HAKKARAINEN J, JOKELA H, PAKARINEN P, et al. Hydroxysteroid (17β)-dehydrogenase 1-deficient female mice present with normal puberty onset but are severely subfertile due to a defect in luteinization and progesterone production[J]. Faseb Journal, 2012, 29(9):3 806-3 816.
[25] 朱鹏, 庞春英, 邓廷贤, 等. 水牛HSD17B1基因克隆分析及其真核表达载体构建[J].中国畜牧兽医，2016，43(3)：559-567。