4种芒属植物的核型分析及亲缘关系探讨

4种芒属植物的核型分析及亲缘关系探讨
唐艳梅;易自力;邓果特;杜凤;项伟;郑铖;刘清波;刘福来;肖亮
【摘要】以芒、五节芒、荻和南荻4种芒属植物共36份种质为材料,分别采用流式细胞仪和压片法对倍性及核型进行分析.结果表明:4种芒属植物中,南荻的荧光值最大,其次为芒,荻的荧光值最小,但不同种间无显著性差异;南荻的荧光值变异系数最大(37.73％),五节芒的荧光值变异系数最小(4.41％),说明南荻的倍性最丰富,而五节芒的倍性最稳定;芒属植物染色体基数为19(x=19),36份种质中有33份材料属二倍体(2n=2x=38)型、2份材料属三倍体(2n=3x=57)型、1份材料属四倍体
(2n=4x=64)型,表明自然界中芒属植物主要以二倍体存在,偶见三倍体和四倍体;不同种之间的核型参数有差异,但都是由中部和近中部着丝粒染色体组成,且芒和五节芒的核型都为\"2B\"型,而荻和南荻大部分为\"2C\"型,说明芒和五节芒亲缘关系近,而荻和南荻亲缘关系近.对核型参数进行聚类分析,可将36份芒属植物材料分为3类:第Ⅰ类为芒类群,主要为芒和五节芒;第Ⅱ类为荻类群,主要包括荻和南荻;第Ⅲ类则为多倍体类群.
【期刊名称】《湖南农业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2018(044)005
【总页数】8页(P487-494)
【关键词】芒属;染色体;核型分析;亲缘关系
【作者】唐艳梅;易自力;邓果特;杜凤;项伟;郑铖;刘清波;刘福来;肖亮
【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙
410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科
学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128
【正文语种】中文
【中图分类】S564+.4
芒属(Miscanthus)是禾本科的多年生C4类高大草本植物，被认为是目前最具开发潜力的高产纤维类能源植物之一[1]。

芒属植物全世界有14个种，中国有7个种。

芒属植物中的芒(M. sinensis)、五节芒(M. floridulus)、荻(M. sacchariflorus)和
南荻(M. lutarioriparius)的生态适应性强，生物质产量高，且分布广泛，易发生种间杂交，具有丰富的遗传多样性[2]，是可作为能源植物利用的理想种类[3]。

倍性鉴定是了解物种遗传背景和种质资源利用的基础。

目前，鉴别染色体倍性的最快速且有效的方法是流式细胞仪测定法(flow cytometry，FCM)。

该项技术根据
物理、化学及生物学特性对细胞群进行定量分析、分选，将检测样本与标准二倍体细胞的荧光值相比较，推算出待检测样本的染色体倍性水平[4]。

核型是真核生物
在染色体水平上的表型。

染色体是遗传物质的主要载体，是基因的携带者。

染色体变异必然导致遗传变异的发生，是生物遗传变异的重要来源。

在植物的天然居群中一般都存在着一定程度的染色体变异，这些变异对研究物种起源、系统进化以及种质资源系统发育过程中的亲缘关系，特别是对于植物近缘类型或种内的分类具有重要意义[5]。

目前，国内外对芒属植物的研究主要集中于系统分类[6]、生态及生物学特性[7]、
遗传多样性分析[2]、分子标记[8]和开发利用[9]等方面。

在细胞学方面，报道的资料主要限于染色体计数，而关于芒属植物核型变异的研究少见报道。

仅有个别学者
对4种芒属植物的核型进行了研究[10–14]；但由于他们使用的试样过于单一，导致所得的核型存在较大的差异。

本研究中，采用流式细胞仪和染色体压片法对36
份不同来源的芒属植物种质资源进行了倍性及核型分析，旨在探讨芒属植物遗传变异、亲缘关系和进化趋势的细胞学依据，以期为芒属植物种质创新和开发利用提供参考。

供试材料：芒13份、五节芒9份、荻8份、南荻6份，共36份芒属植物种质(表1)。

以上材料均种植于湖南农业大学芒属植物种质资源圃。

1.2.1 倍性检测
取20 mg幼嫩叶片，去叶脉后置于干净的培养皿中，加入Galbraith’s
Buffer(含45 mmol/L MgCl2，30 mmol/L柠檬酸钠，20 mmol/L 3–(N–吗啡啉)丙磺酸(pH 7.0)，0.1% Triton X–100，50 μg/mL RNaseA)细胞核提取液，用刀
片迅速将其切碎，在提取液中充分浸提。

用孔径0.038 5 mm的钢筛将混合液过
滤至2 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，再加入500 μL细胞
核提取液，振荡混匀后获得细胞核悬液，置于冰上，备用。

向制备好的细胞核悬液中滴加碘化丙啶染色液(propidium iodide，PI)至终质量浓度为50 μg/mL，黑暗条件下染色30 min。

采用Beckman Coulter Epics XL流式细胞仪进行倍性分析，每个待测样本至少收集10 000个细胞并重复检测3次；采用EXPO32 ADC analysis对测得的图像和数据进行处理。

1.2.2 染色体标本制备与核型分析
采用压片法制备4种芒属植物的染色体装片。

取材料的幼嫩根尖，用0.2%秋水仙素和0.002 mol/L 8–羟基喹啉混合溶液预处理2 h，经蒸馏水清洗后转至卡诺氏
固定液中固定24 h以上，置于4 ℃冰箱内保存，备用。

固定好的根尖先用1
mol/L盐酸在60 ℃下酸解15 min，再用2%纤维素酶液在28 ℃下酶解1 h，再
固定。

切取少量处理过的根尖的分生区组织于载玻片上，用改良苯酚品红染液染色
10 min左右，盖上盖玻片，压片，在Motic BA400显微镜下镜检。

挑选分散良好且形态清晰的中期分裂相，用Moticam 5000数码成像系统和Motic Images Advanced 3.2软件进行拍照、保存及相关核型参数的测量。

染色体核型分析按李懋学等[15]的方法进行；核型分类按文献[5]的标准划分；核型不对称系数按ARANO[16]的方法计算。

采用Excell进行数据整理；采用DPS进行最大值、最小值、平均值、变异系数的统计；采用SPSS以似近系数非加权组平均法进行核型聚类分析。

23号荻的DNA相对含量荧光值为211，该材料通过染色体制片确定了染色体数目为38；因此，设该份荻为对照，对4种芒属植物的供试种质材料进行了流式细胞分析。

具代表性的9份材料的流式细胞仪测定的峰形图如图1所示。

图1中，横坐标代表DNA相对含量的荧光值，纵坐标代表测定细胞数。

荧光值的统计结果如表2所示。

芒的荧光值变化范围为231.7~372.9，平均值为254.5，变异系数为14.52%，其中采自陕西凤县的11号材料的荧光值为372.9，为三倍体；五节芒荧光值变化范围为236.8~265.6，变异系数为4.41%，五节芒中未发现有多倍体；荻的荧光值为211.0~315.6，变异系数为15.60%，其中采自山东日照的28号材料的荧光值为315.6，为三倍体；南荻的荧光值变化范围为195.2~448.1，变异系数为37.73%，在6份南荻中检测到1份荧光值为448.1的材料(编号34，采集地为江苏南京)，可判断为四倍体。

从荧光值的大小来看，荧光值从大到小的芒属植物顺序为南荻、芒、五节芒、荻，但不同种间无显著性差别。

荧光值的变异系数可以反映4种芒属植物倍性的丰富程度。

研究结果(表2)显示，南荻的变异系数最大(37.73%)，五节芒的变异系数最小(4.41%)，说明南荻的倍性最丰富，而五节芒的倍性最稳定。

36份芒属植物的核型参数见表3。

13份芒的核型都为“2B”型，但核型公式存在明显的差异，有14～16对中部着
丝粒染色体和3～5对近中部着丝粒染色体，染色体相对长度变化范围为1.12～11.65，染色体长度比为2.33～4.00，核型不对称系数为0.558 9～0.579 3。

除
11号材料为三倍体外，其余都为二倍体。

9份五节芒都是二倍体。

除了15号采自广西金秀的五节芒的核型类型为“2C”型外，其余均为“2B”型。

除采自浙江龙游(22号)和广西金秀(15号)的五节芒的染
色体组是由14对中部着丝粒染色体和5对近中部着丝粒染色体组成外，其他材料的染色体组成一致，包括15对中部着丝粒染色体和4对近中部着丝粒染色体。

染色体相对长度变化范围为1.54～11.11，染色体长度比为2.12～5.98，核型不对
称系数为0.553 9～0.588 2。

8份荻的核型都为“2C”型。

不同来源材料的核型公式存在差异，有14或15对
中部着丝粒染色体和4或5对近中部着丝粒染色体，染色体相对长度的变化范围
为1.70～10.35，染色体长度比为4.01～4.42，核型不对称系数为0.553 1～
0.614 3。

除28号材料为三倍体外，其余都为二倍体。

6份南荻的染色体组成较为稳定，都是由14对中部着丝粒染色体和5对近中部着丝粒染色体组成。

染色体相对长度的变化范围为1.96～9.84，染色体长度比为
2.75～4.85，核型不对称系数介于0.560 8～0.593 5。

除31、35号材料的核型
类型为“2B”型外，其余均为“2C”型。

除采自江苏南京的34号南荻为四倍体外，其余都为二倍体。

参照耿帆等[17]的方法，对36份芒属植物的核型参数，包括倍性、核型公式、核
型类型、平均臂比、臂比>2的染色体比率、染色体长度比和核不对称系数进行系统聚类分析，结果如图2所示。

当欧氏距离为15时，可将36份材料分为3类：
第Ⅰ类可以命名为芒类群，以芒和五节芒为主，包括11份芒(1、2、3、4、5、7、8、9、10、12、13号)，8份五节芒(14、16、17、18、19、20、21、22号)以
及1份南荻(31号)；第Ⅱ类可以命名为荻类群，以荻和南荻为主，包括7份荻(23、
24、25、26、27、29、30号)，4份南荻(32、33、35、36号)，1份芒(6号)和
1份五节芒(15号)；第Ⅲ类命名为多倍体类群，由11号、28号和34号组成，分别是采自陕西凤县的三倍体芒、山东日照的三倍体荻和江苏南京的四倍体南荻。

a. 关于芒属植物的染色体倍性。

自然界中的芒属植物主要以二倍体存在，少有三
倍体和四倍体。

多倍化是高等植物对环境变化的一种适应，也是促进植物物种形成和多样化的重要途径。

多倍化在自然界中普遍存在，几乎所有植物在其进化过程中都要经历1次或多次多倍化。

研究[18]发现，多倍体在高纬度、高海拔和干旱等极端环境中发生更为频繁，响应环境波动的植物往往能够产生更高频率的未减数配子。

芒属植物的四倍体可能是在特殊的环境条件下，由未减数的2n配子融合和体细胞染色体数加倍2种途径产生的，而三倍体可能是通过未减数配子与正常配子融合
或由二倍体和四倍体杂交而来，如三倍体芒草“奇岗”就是由二倍体的荻经染色体加倍后与二倍体的芒杂交产生的[13,19]。

b. 关于芒属植物的染色体核型。

一般来说，生长在高纬度地区的植物的基因组比
低纬度地区的植物的基因组要小，而生长在湿润地区的植物的基因组要比生长在较干燥栖息地的植物的基因组更大[20]。

据SHENG等[21]研究报道，地理隔离和环境都会影响南荻的DNA含量。

然而，植物的核型结构差异可能与其分布生境的不同有关。

芒属植物的生态幅宽，适应能力强，各种环境下都有其种类生存。

为了克服环境变化带来的不利，芒属植物常通过发生染色体变异来增强对新生境的适应性。

供试36份材料分别采自中国各地区的不同生境，这促进了芒属植物染色体结构变异的发生，具体表现在m、sm染色体数目有差异，并存在m染色体向sm转化
的现象。

染色体结构变异可以产生新的等位基因，改变基因组结构，使种内出现核型变异，这很好的解释了芒属植物具有丰富的种间和种内遗传多样性的原因。

c. 关于芒属植物的亲缘关系与系统进化。

染色体核型是研究属下或种下等级物种
或居群的亲缘关系和演化趋向的重要方法[22]。

核型相似程度往往与核型同源性和
亲缘关系存在一致性，物种间在分类阶梯上越远，它们的核型差异越大[23]。

对
36份不同来源芒属植物进行核型聚类，芒和五节芒首先聚为一类，南荻和荻也可以聚为一类，说明芒和五节芒、南荻和荻的亲缘关系近。

这与陈少风[11]利用ISSR标记对4种芒属植物进行的聚类分析结果一致。

STEBBINS[5]认为，在整个
植物界核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展，系统演化上处于比较古老或原始的植物往往具有较对称的核型，而不对称的核型主要存在于较进化的植物中。

从本研究结果来看，除采自广西金秀的五节芒核型类型为“2C”型外，所有芒和五
节芒的核型类型都为“2B”型；而在荻和南荻中，除采自安徽东至和江西湖口的
南荻的核型类型为“2B”外，其余材料均为“2C”型。

根据STEBBINS[5]的核型分类划分标准，“2B”类型较“2C”类型对称性更高，因此，荻和南荻比芒和五节芒的进化程度更高。

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