9.27蛋白质2

谷氨酸钠就是所谓的“味精”
2. 两性性质和等电点
水、晶体
NH3+ NH3+ NH2 | +OH| +OH| H-C-COOH ======== H-C-COO- ====== H-C-COO| +H+ | +H+ | R R R 正离子 两性离子 负离子 pH < pI pH = pI pH > pI 氨基酸同时含有氨基和羧基：既能放出质子，又能接受质子
+NH 3
-S S-CH2-CH-COO2
+NH
二硫键
3
胱氨酸
一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。
蛋白质的根本差异在于一级结构的不同
胰岛素的一级结构
2 多肽链中氨基酸序列分析
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成
测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基
把肽链水解成片段，分别进行分析
测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法
主要功能:
H2O2 2GSH
GSH过氧 化物酶
NADP+
GSH还原酶
2H2O
GSSG
NADPH+H+
（辅酶）
GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H2O2还原成H2O，其自身被 氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），而GSSG在谷胱甘肽还原酶的作用 下还原成GSH
2.3.3 活性肽的来源
1） 体内途径：多数是从非活性的蛋白质前体经过特 殊的酶系加工而形成的。加工修饰包括：多肽链
裂解、酰化、乙酰化和硫脂化。
2） 体外途径： 分离纯化天然活性肽 化学合成制备活性肽 生物合成制备活性肽
酶法水解制取活性肽
2.3.4 生物活性肽的应用
1） 功能性食品：具有一定功能的肽类食品，目前是 国际上研究的热点。日本、美国、欧洲已推出具有各 种各样功能的食品和食品添加剂。
2） 肽类试剂：纯度非常高，主要应用在科学试验和
多肽链
由酰胺N、 -碳和羰基C重复单位构成的链状结构称为主链， 每个氨基酸残基的R基称为侧链
多肽链
侧链 肽键
侧链
主链
*
多肽有两端：
N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端
多肽链的书写：N 端写在左边，C 端写在右边
多肽链的命名
•
由N 端开始，连续读出氨基酸残基的名称，除C端氨基酸 外，其他氨基酸残基的名称均将“酸”改为“酰”，即依次
蛋白质含量计算
蛋白质元素分析： 碳 氢 氧 氮 硫 —— —— —— —— —— 50-55% 6-8% 20-23% 15-18% 0-4%
（平均16%）
无机化
凯氏定氮法
蛋白质含量 = （总氮含量-无机氮含量）× 6.25
2.2.3 氨基酸的理化性质
1. 一般物理性质
氨基酸是离子化合物。 熔点较高（200 º C～300 º ） C 能溶于水，不溶于有机溶剂
＋
＋
CH－NH3
CH－NH2 (CH2) 4
＋
CH－NH2 (CH2) 4 NH2
(CH2) 4
＋
NH3
＋＋
K1'
NH3
K2'
＋
NH3
K3'
±
Lys
Lys
Lys
溶液 pH 值增大
Lys
－
pI = 1/2 ( pK2' + pK3' )
3. 重要的化学性质
(1) 水合茚三酮反应(ninhydrin reaction)
(1) 蛋白质二级结构
蛋白质的二级结构指：多肽主链有一定的周期
性的，由氢键维持的局部空间结构。
主要形式： • -螺旋 ( -helix )
• -折叠 ( -pleated sheet ) • -转角 ( -turn ) • 自由回转 ( random coil )
-螺旋 结构要点:
H
H C N O
H C COOH R2
二肽：如丙氨酰甘氨酸
肽键
* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。
• 两分子氨基酸缩合形成二肽 • 三分子氨基酸缩合则形成三肽
* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基 酸残基。
• 由12-20个氨基酸相连而成的肽称为寡肽 • 由20个以上的氨基酸相连形成的肽称多肽。
氨基具有碱性，羧基具有酸性
使氨基酸所带净电荷为零时溶液的pH值，称为等 电点 (用 pI 表示)
pI 是氨基酸的特征常数 运用：沉淀氨基酸 分离氨基酸
等电点的应用1------电泳分离
• 应用------氨基酸的分离与分析 • 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象称为电泳 • 酸性不同（pI不同，大小不同），在电场中泳动速度不同，因此可以 通过电泳将氨基酸彼此分开 • 当pH=pI时，氨基酸呈兼性离子，在电场中不移动 • 当pH>pI时，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动 • 当pH<pI时，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动 蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电 场的正极或负极移动，从而分离蛋白质。
等电点应用2------蛋白质沉淀与分离
处于等电点的蛋白质溶解度最小。当蛋白质混合
物的 pH 被调到其中一种成分的等电点时，该蛋白质
将大部分或全部沉淀下来。那些等电点高于或低于该
pH的蛋白质仍保留在溶液中，可利用此性质进行蛋
白质的分离。这样沉淀出来的蛋白质保持天然构象， 能再溶解于水并具有天然的活性
①从N端为起点，多肽链主链围绕中心轴形成螺旋形状，侧链 伸向螺旋外侧。
每个肽键的亚氨氢和第四 个肽键的羰基氧形成的氢键保 持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴 基本平行。
每圈螺旋含3.6个氨基酸， 螺距为0.54nm， 两个氨基酸残基间距0.15nm 不计侧链，螺旋直径约为0.6nm。
空间填充模型结构 黄色部分为氢键
免疫防御、生殖控制、抗衰防老、生物钟规律、分子进化
等几乎所有的生命活动。
谷胱甘肽(glutathione, GSH)
结构:
a) 谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽 b) －SH为活性基团，是生物体内重要的还原剂，保护蛋 白质和酶 c) －SH还具有嗜核特性，帮助保持正常的免疫系统功 能 d) 药理作用：可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基 排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。
O OH OH O O R CH COOH NH2 O H OH
+
+ RCHO + NH3 + CO2
水合茚三酮
氨基酸
茚三酮(还原型)
醛
2
茚三酮
蓝紫色化合物
茚三酮反应常用于aa的定性和定量分析
在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成蓝紫色化合物
脯氨酸的茚 三酮反应呈 黄色
(2) Sanger反应
在弱碱溶液中，氨基酸的α-氨基与2,4-二硝基氟苯
可以稳定存在，可用液相色谱定性和定量
此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理
2.3 肽
2.3.1 肽(peptide)的结构
• 肽：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的
-氨基脱水缩合而形成的化合物。由两个氨基酸
缩合形成的称为二肽。
• 肽键：氨基酸脱水后形成的化学键。
R1 H2N C C H O H OH + H N C COOH H R2 H2O R1 H2N C
20种氨基酸的pI
氨基酸 Ala丙 Val缬 Leu亮 pI 6.02 5.97 5.98 氨基酸 Pro脯 Phe苯 Trp色 pI 6.48 5.48 5.89 氨基酸 Thr苏 Cys半 Tyr酪 pI 5.87 5.07 5.66 氨基酸 pI
Asp天 2.77 Glu谷 3.22 Lys赖 9.74
(DNFB) 反应，生成黄色的2,4-二硝基苯基氨基酸（DNP-
AA）
DNFB
DNP - 氨基酸
此反应最初被Sanger 用于测定胰岛素一级结构
1918-, 英国生物化学家, 曾获 1958年诺贝尔化学奖
(3) Edman反应
PITC
异硫氰酸苯酯
PTC- 氨基酸
苯氨基硫甲酰氨基酸
PTH- 氨基酸 苯硫乙内酰脲氨基酸
肽单元
肽单元：
参与组成肽键 的6个原子位于同一 平面，又叫酰胺 平面或肽键平面。
R O N O R C Cα N
Cα
ψ
φ
C
它是蛋白质构象的
基本结构单位，又 称肽单元。
氢键稳定螺旋结构
螺旋的肽平面
空间填充模型结构
带状结构
-螺旋结构示意图
由于α-螺旋结构的每圈螺旋含3.6个氨基酸，由氢 键封闭形成的环含有13个原子，因此被称作3.613-螺旋。 天然蛋白质中：310-螺旋，4.416-螺旋。
称为某氨酰某氨酸。如，丙氨酰酪氨酰甘氨酸：
• 为了方便，常简称为丙-酪-甘或Ala-Tyr-Gly。 • 若只知道氨基酸的组成，不知道序列：（Ala，Tyr,Gly） （Ala，Cys2，Gly）
N末端
C末端
牛核糖核酸酶
2.3.2 生物活性肽
生物活性肽是能够调节生物机体的生命活动或具有某些生 理活性的寡肽或多肽的总称。 化学信使：沟通细胞内部、细胞与细胞间以及器官与器官 之间的信息。 参与生物的生长发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、
一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→ 四级结构
2.4.1 蛋白质的一级结构
定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的序列。 主要化学键：肽键 二硫键
牛胰岛素一级结构
-OOC-CH-CH
+NH 3
-SH + HS-CH2-CH-COO2
-HH
+NH 3
半胱氨酸
-OOC-CH-CH
• 等电点时溶液的pH与氨基酸浓度无关。
等电点计算
例： 甘氨酸Gly 的pI 计算
+
NH3 -CH2 -COOH H NH3 -CH2 -COO H NH2 -CH2 -COO
-
H
+
H
Gly
＋
K1'
Gly
±
K2'
Ile异
Met甲
6.02
5.74
Gly甘
Ser丝
5.97
5.68
Asn天
Gln谷
5.41
5.65
Arg精 10.76
His组 7.59
氨基酸等电点的计算
两性离子两边的pK值的算数平均值，即为等电点 公式：pI=(pKn+pKn+1)/2
• n:氨基酸完全质子化时带正电荷基团的个数
• pK：解离基团的解离常数
一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然 后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序结果。
如:测一个九肽
测得N端氨基酸残基为Thr（苏） 又分别测得片段: Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-Trp Thr-Asn-Val-Lys 则其氨基酸排列顺序为： Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys
生化检测上，价格十分昂贵。 3）肽类药物。
2.4 蛋白质的分子结构
一级结构 (primary structure)
二级结构 (secondary structure)
三级结构 (tertiary structure) 高级结构 空间结构
四级结构 (quaternary structure)
蛋白质分子中的结构层次
Gly
－
K1' 、K2'分别代表COOH和NH3+的表观解离常数。
pK1 ' pK 2 ' pI 2
谷氨酸的解离
pI = 1/2 ( pK1 + pK2)
例:赖氨酸的pI 计算
COOH
＋
COO
－H+ ＋H +
－
COO－
－H+ ＋H +
COO－
－H+ ＋H +
CH－NH3 (CH2) 4
（苏） （天） （缬） （赖） （丙） （色） （甘） （赖）
2.4.2 蛋白质的空间结构
定义：蛋白质的空间结构通常称作蛋白质的构象，或高级
结构，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的分布和肽链
的走向。
稳定因素：①氢键、②盐键、③疏水键、④范德华力⑤二硫键
疏水键: 多肽链上疏水性较强的氨基酸的非极性侧链避开水相自相粘附 聚集在一起，形成空穴。 离子键（盐健）:由蛋白质中正、负电荷的侧链基团相互接近，通过静 电吸引而形成的基团之间的作用力。 氢键：一个电负性原子上共价连接的氢，与另一个电负性原子之间的静 电作用力 范德华力：由瞬间偶极诱导的静电相互作用形成的