胶乳增强免疫比浊法检测血清25-羟维生素D的性能验证

doi:10.3969/j.issn.1009-881X.2020.03.027
胶乳增强免疫比浊法检测血清25-羟维生素D的性能验证
刘琴1，王玲萍1，陆仁伟1，陆茜莹1，许中2
(1.苏州市相城区漕湖人民医院检验科，江苏苏州 215144；2.苏州市立医院东区检验科，江苏苏州 215001）
摘要：目的 验证一种新上市的总25-羟维生素D[25(OH)D]检测试剂的方法学性能。

方法性能验证使用苏州博源公司生产的总25-羟维生素D检测试剂，验证该试剂的正确度、精密度、线性、最大稀释倍数、分析灵敏度，方法学验证采用罗氏诊断的试剂作为参比试剂，对临床样品进行评价。

结果总25-羟维生素D不同浓度水平血清样品：低值（19.36 ng/mL）、中值（54.51 ng/mL）、高值（97.80 ng/mL）的加标回收率分别为106.2%、102.3%、99.8%；低值、高值血清样品的批内精密度和总精密度分别为2.87%、1.42%和3.60%、2.09%，小于厂商声明的1/4TEa（6.25%）和1/3TEa（8.33%）；线性范围为8.0～152.0 ng/mL；分析灵敏度符合厂商声明标准（2.9 ng/mL）。

方法学比对收集健康体检者及患者血清样品（n＝110），分别使用苏州博源（试验方法，Y）与罗氏诊断（参比方法，X）的总25-羟维生素D试剂进行检测，Deming回归方程为Y ＝－2.5853＋1.0410X，相关系数r＝0.951，Bland-Altman图中95.5%（105/110）的点落在95%一致性界限内。

结论苏州博源总25-羟维生素D的正确度、精密度、线性范围、最大稀释倍数、分析灵敏度和参考区间满足性能验证要求，样品比对结果与罗氏诊断试剂具有一致性，可满足临床应用要求。

关键词：总25-羟维生素D；血清；胶乳增强免疫比浊法
中图分类号：R541.6 文献标识码：A 文章编号：1009-881X(2020)03-0369-04 Determination of Serum 25-Hydroxyvitamin D by Latex-enhanced Immune
Turbidimetry
LIU Qin1, WANG Ling-ping1, LU Ren-wei1, LU Xi-ying1, XU Zhong2
(1.Clinical Laboratory, Caohu People's Hospital, Suzhou, Jiangsu, 215144, China; 2.Clinical Laboratory, East
District of Suzhou Municipal Hospital, Suzhou, Jiangsu, 215001, China) Abstract：Objective To verify the methodological performance of a newly marketed total 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D)]detection reagent. Methods A total 25-hydroxyvitamin D test reagent produced by Suzhou Boyuan Company, verifying the correctness, precision, linearity, maximum dilution multiple, analytical sensitivity of the reagent, methodological validation using Roche diagnostic reagent as reference reagent, clinical samples were evaluated. Results Standard-added recovery of serum samples with different concentrations of 25-hydroxyvitamin D: low value (19.36 ng/mL), median value (54.51 ng/mL), high value (97.80 ng/mL) were 106.2%, 102.3%, 99.8%, respectively; the in-batch precision and total precision of low and high value serum samples were 2.87%, 1.42% and 3.60%, 2.09%, less than 1/4 Tea (6.25%) and 1/3 Tea (8.33%); the linear range was 8.0-152.0 ng/mL; analytical sensitivity meets manufacturer's declaration standard (2.9 ng/mL). Methodological comparison of serum samples collected from health checkers and patients (n＝110), using Suzhou Boyuan (test method, Y) and Roche Diagnostics (reference method, X) total 25-hydroxyvitamin D reagent, Deming regression equation is Y＝－2.5853＋1.0410X, correlation coefficient r＝0.951, bland-altman 95.5%收稿日期：2020-07-26 作者简介：刘琴(1975—),女,江苏苏州人,学士,副主任技师,主要从事临床生化检验及实验室管理。

通讯作者：许中，***************
(105/110) of the points in the figure falls within the 95% limit. Conclusion The accuracy, precision, linear range, maximum dilution multiple, analytical sensitivity and reference interval of total 25-hydroxyvitamin D in Suzhou Boyuan meet the requirements of performance verification. The results of sample comparison are consistent with Roche Diagnostic reagent and can meet the requirements of clinical application.
Key words：total 25-hydroxyvitamin D; serum; latex enhanced immune turbidimetry
维生素D（Vitamin D, VD）是一种脂溶性固醇类物质，是人体必需维生素，主要以麦角钙化醇（维生素D2）和胆钙化醇（维生素D3）两种无活性形式存在，人体不能自身合成，需通过紫外线照射皮肤合成或者直接从植物中摄取[1]。

VD的主要生理作用是维持机体钙磷代谢，进而保证骨骼健康，VD缺乏或不足可导致佝偻病、软骨病等骨骼系统疾病，还与自身免疫性疾病、心血管疾病、抑郁症、糖尿病等疾病关系密切[2-6]，因此，VD缺乏已经成为一个全球公共卫生问题，VD检测也日益成为临床检验关注焦点。

VD在体内经25羟化酶催化合成25-羟维生素D[25(OH)D]，再经25(OH) D-1α羟化酶催化成1,25(OH)2D，后者是VD发挥其生理作用的主要活性物质，但是其含量极少，半衰期短，且受血钙、磷和甲状旁腺激素（PTH）水平的影响[7]，而25(OH)D是VD的主要储存形式，能充分反映体内VD总量和转化能力。

因此，血清总25-羟维生素D被认为是评估体内VD状态的最为有效的指标。

本研究旨在通过对苏州博源医疗科技有限公司（以下简称“苏州博源”）生产的总25-羟维生素D 检测试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）进行方法学性能评估，并通过与罗氏诊断（上海）产品有限公司（以下简称“罗氏诊断”）代理的进口产品25-羟维生素D检测试剂盒（电化学发光法）进行方法学比对，评价两者之间的一致性。

1 材料与方法
1.1 样品来源
1.1.1 试剂性能验证样品：(1)正确度评估试验样品：选择低、中、高值血清样品，每个样品分别加入一定体积的25-羟维生素D3标准溶液（北京中科），制成待回收分析样品。

(2)精密度评价试验样品：低值和高值血清样品。

(3)线性评估试验样品：选择低值和高值两个浓度的血清样品，按比例配制成不同梯度的线性评估样品。

(4)灵敏度评估实验样品：纯水和低浓度血清样品。

以上血清样品均来自2019年5月—10月苏州市立医院东区检验科血清样本，样品收集后在我－20 ℃下冻存。

1.1.2 方法学比对验证样品：选取苏州市立医院东区2019年5月—10月无溶血、脂血、黄疸新鲜血清样品110 例，样品收集后在－20 ℃下冻存。

1.2 主要仪器与试剂 7600全自动分析仪（日本日立公司）。

总25-羟维生素D试剂及其配套校准品和质控品分别来自苏州博源和罗氏诊断公司，批号分别为191213和191210，前者为试验试剂，后者为参比试剂。

按照制造商提供的说明书设置相应参数，并按照标准化操作程序完成校准和质控。

1.3 方法
1.3.1 正确度：选择3个不同浓度水平的血清样品，分别在血清样品（浓度C0，体积V0＝0.9 mL）中加入一定量的标准溶液（浓度Cs＝150 ng/mL，体积V＝0.1 mL），配制成待测回收样品（浓度C）。

每个样品重复测定3 次，计算每个样品的回收率（R），计算公式：R（%）＝[C×(V＋V0)－C0×V0]/(Cs×V)×100%[8]。

1.3.2 精密度：参考CLSI EP15-A文件方案[9]，选取低值和高值两个浓度的血清样品连续进行5 d的测定，每日一个批次，每个样品重复测定4 次。

1.3.3 线性范围：参考CLSI EP6-A文件方案[10]，将低水平混合血清（ L：8 ng/mL）和高水平混合血清（ H：152 ng/mL）按照比例L、4L＋1H、3L＋2H、2L＋3H、1L＋4H、H进行稀释，配制成6个梯度的混合血清。

各浓度梯度混合血清测定2 次，以预期浓度为X轴，实测浓度为Y轴绘制散点图，计算回归方程和R2，通过EP软件进行统计分析。

预期浓度计算公式：X＝(CL×VL＋CH×VH)/(VL ＋VH)。

其中：CL：低水平混合血清样品的浓度，VL：低水平混合血清样品的体积，CH：高水平混合血清样品的浓度，VH：高水平混合血清样品的体积。

1.3.4 分析灵敏度：参考CLSI EP17-A方案[11]，在同一批内连续测定空白样品纯水和低浓度样品各20 次，记录测定结果。

计算空白检测限（limit of blank, LOB）和分析灵敏度（limit of detection,
LOD ）。

空白样品的测定值以不超过3个大于厂商声明的LOB （1.2 ng/mL ）认为结果可接受；低浓度样品测定结果中以不超过5%（1个）小于厂商声明的LOD （2.9 ng/mL ）认为分析灵敏度符合要求。

1.3.5 临床样品比对：选取本院2019年5月—10月无溶血、脂血、黄疸的新鲜血清样品110 例，分别用苏州博源和罗氏诊断的25-羟维生素D 试剂进行检测，比对试验统计根据MedCalc 软件中方法比对和评估进行。

1.4 统计学分析 所用统计量及统计图表均由MedCalc 分析软件计算绘制。

2 结果
2.1 正确度 低、中、高浓度血清样品的回收率分别为106.2%、102.3%、99.8%，在生产厂商声明的范围内，结果见表1。

表1 正确度评估试验结果
序号样品测定结果平均值C0（ng/mL ）
加入标准液后测定结果平均值C （ng/mL ）
回收率R （%）
可接受标准119.36 33.35 106.2%90%～110%254.51 64.40 102.3%90%～110%3
97.80
102.98
99.8%
90%～110%
2.2 精密度 低值血清样品的批内精密度为2.87%，小于厂商声明的1/4TEa （6.25%），总精密度为
3.60%，小于厂商声明的1/3TEa （8.33%）；高值
血清样品的批内精密度为1.42%，小于厂商声明的1/4TEa （6.25%），总精密度为2.09%，小于厂商声
明的1/3TEa （8.33%）。

2.3 线性范围 该试剂在8.0～152.0 ng/mL 范围内线性关系良好，回归方程为Y ＝－2.5853＋1.0410X ，R 2＝0.996。

散点图见图1。

图1 线性范围散点图
2.4 分析灵敏度 测定结果中符合条件的空白样品的测定值个数为20个，所有低浓度样品测定结果均大于厂商声明的LOD ，因此该试剂的分析灵敏度符合要求。

2.5 临床样品比对 Deming 回归图见图2，回归方程的截距（intercept ）和斜率（slope ）分别为－2.59（95%CI ：－
3.81～－1.37）和1.04（95%CI ：0.98～1.11），r 为0.951，线性相关性良好。

以苏州博源和罗氏诊断测定结果的均值为X 轴，比值为Y 轴绘制Bland-Altman 图（见图3），结果显示，95%一致性界限为（0.43,1.33），有95.5%（105/110）的点落在一致性界限范围内，可见两种检测方法的
检测结果一致性良好。

图2 Deming 回归图
图3 Bland-Altman 图
3 讨论
本文参照CLSI 文件对苏州博源的总25-羟维生素D 试剂正确度、精密度、线性范围、分析灵敏度等重要指标进行了评价。

结果显示，采用回收实验验证试剂正确度符合厂商声明的可接受范围，低、中、高浓度血清样品的回收率分别为106.2%、
检测均值(n g /m L )
理论值(ng/mL)
博源结果(n g /m L )
罗氏结果(ng/mL)
R a t i o o f 博源结果 (n g /m L ) a n d 罗氏结果(n g /m L )
Mean of 博源结果 (ng/mL) and 罗氏结果(ng/mL)
102.3%、99.8%；低值、高值血清样品的批内精密度和总精密度分别为2.87%、1.42%和3.60%、2.09%，小于厂商声明的1/4TEa（6.25%）和1/3TEa （8.33%）；线性范围为8.0～152.0 ng/mL，符合厂商声明的范围；分析灵敏度符合厂商声明的值（2.9 ng/mL）；参考区间验证符合厂商声明的参考区间（＞30 ng/mL）。

与同类产品罗氏诊断进行了方法学比对，结果一致性良好。

试剂符合实验室质量要求，适用于实验室常规检测的开展。

目前，25-羟维生素D的检测方法有放射免疫法、酶免疫法、化学发光法、高效液相色谱法、胶乳增强免疫比浊法等[12-13]。

免疫分析法原理是基于抗原抗体的结合，适用于全自动分析仪，操作简单，分析速度快，可实现高通量检测，只是不能区分维生素D2和D3，临床上一般用于检测总25-羟维生素D。

LC-MS/MS被认为是公认的测定25-羟维生素D的金标准，敏感性高、特异性强。

但是，目前市面上25-羟维生素D测定结果之间可比性较差，检测方法的一致性有待提高[1]。

对于免疫法来说，不同厂家的试剂抗体交叉反应差异显著；LC-MS/MS 方法则会受到3-表-25-羟维生素D的干扰，而且检测方法大多由实验室自主研发和验证，各仪器厂家方法间结果可比性差，方法的标准化也亟待解决，而且仪器价格偏高，对实验室条件及操作人员技术要求严格，所以不能广泛应用于大多数实验室。

随着社会经济发展和生活方式的改变，VD不足或缺乏的情况日渐普遍，而VD有着非常重要的生理作用，不仅在钙磷代谢和骨骼发育中至关重要，还与心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病、肥胖等疾病相关，因此，VD的检测值在各个实验室广泛推广和使用。

25-羟维生素D作为VD在体内的主要储存物质可作为检测的最佳指标，但是，临床的应用需要解决很多问题，还有许多工作需要进一步完善，本研究也是笔者一直在不断深入探索的一部分，希望能为检验领域解决更多亟待解决的问题。

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