PCR扩增检测转基因大豆、玉米

【实验步骤】 基因组DNA浓度和纯度的鉴定
取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中，用 Biophotometer分 析DNA的浓度，通过它对提取大豆DNA测OD值。并记 录数据。由OD260nm/OD280nm判定基因组DNA的浓度， 其比值在1.7~2.0之间较好，符合PCR检测要求。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是 一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 。 它 包 括 : 变 性 (Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基
外源基因( EPSPS)特异性扩增 12 3 4567M 12
外源终止子(NOS) 特异性扩增
外源启动子(CaMV35S)特 异性扩增
1 未加模板对照 2 转基因大豆、玉米 3~7 非转基因大豆、玉米
PCR假阳性结果 1． 引物设计不当，应调换引物 2． 循环参数不合适，导致非特异性扩增 3． 靶序列的交叉污染
大豆凝集素(Lectin)基因、玉米特异性内源基
因IVR为内参 ？
西医学是最近三四百年来建立在解 剖学、 生物学 及现代 科学技 术基础 上、发 展起来 的一门 以“解 剖人、 肉体人 ”为概 念的、 新兴的 现代医 学科学 理论体 系。主 要采用 科学实 验方法 ，从宏 观到微 观，直 至目前 的分子 基因层 次水平 ，发展 极为迅 速，超 过其它 任何一 门医学 科学， 成为世 界医学 史上的 主流。 医学、比较医学、后现代医学、行为 医学等 所谓“ 医学” ，都称 不上一 门独立 的医学 科学， 关于这 一点在 灵魂医 学有关 章节中 将有相 关点评 。
【实验步骤】
大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法
称取0.1g样品，在研钵中充分研磨。加入1000μL CTAB提取液， 继续研磨充分后加入到1.5mL Ep管中；向EP管加入4μL RNaseA， 至于65℃水浴，过程中混匀3~5次，30min，12000r/min室温离心 10min；取上清于新的Ep管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24: 1)， 轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混匀)，室温静置5min，室温 12000r/min离心10min；重复加入氯仿异戊醇一到两次 (过程中如 上清液量太少，可适量加入三重蒸馏水)；取上清于新的Ep管(千 万不要吸入下层液体)，再加入等体积的CTAB沉淀液，轻缓颠 倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液， 加入400μL 1.2mol/L氯化钠溶解沉淀，56℃温浴15min，期间轻 摇EP管数次助溶；加入800μL -20℃无水乙醇，-20℃静置1h， 15000 r/min室温离心10min；弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两 三次后，在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于4℃。
可见中西医学，一个是以“功能人”为 概念的 独特的 哲学医 学理论 体系， 一个是 以“解 剖人、 肉体人 ”为概 念的新 兴的现 代医学 科学理 论体系 ，二者 都不是 以完整 人为研 究对象 的科学 ，从理 论讲二 者都不 是科学 的，势 必影响 各自发 展。事 实也证 明这一 切，（ df高血 压958心 脏病983u6糖 尿病87fr）中 医长期 停滞不 前、（df高血压 958心 脏病983u6糖尿 病87fr ）疗效 也不确 实。西 医尽管 发展到 目前的 基因分 子层次 ，但疾 病发病 率居高 不下， 对绝大 部分疾 病发病 原因认 识不清 、发病 机理弄 不明白 ，治疗 受到制 约，在 小小SARS、 禽流感 面前竟 束手无 策，在 糖尿病 、癌症 、心脑 血管疾 病、尿 毒症等 相当多 疾病面 前更是 不得不 求助或 借助中 医治疗 。一个 是疗效 不确实 ，一个 是有些 甚至相 当多疾 病无法 治疗， 这就是 中西医 学结合 的缘由 。然而 ，由于 二者是 两套理 论、两 股道上 跑的车 （df肺25s血液f369血 小板t5172红
体积（μL） 37.5 5 4 1 1 0.5 1
反应管放入PCR仪
编辑程序进行扩增
PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。
2. 按下述程序进行PCR扩增:
1） 94℃ 预变性 3 min； 2） 94℃ 变性 1 min； 3） 54℃ ( 或者56℃ )退火 45 sec； 4） 72℃ 延伸 1 min； 5） 重复步骤2~4, 29次； 6） 72℃ 延伸 10 min； 7） End.
标记试管 加入各种试剂、混匀、离心（最后加酶） 设立PCR循环程序，进行扩增
标记PCR反应管
加入试剂
【实验步骤】
1. 在0.2 mL Eppendorff管内调制50 μL反应体系：
反应物
dd H2O PCR缓冲液 （10×） dNTP （2.5mM each） 引物1 引物2 Taq DNA聚合酶 模板DNA
ttc c-3’ (56 ℃)
扩增片段长度
118 bp
226 bp
195 bp 180 bp 320 bp
基因性质
内源基因
内源基因
外源基因 外源基因 外源基因
主要试剂
Taq DNA polymerase
引物对：1μmol/L
底物：10mMdNTP PCR缓冲液 ddH2O
主要实验器材
PCR主要操作步骤
西医学是最近三四百年来建立在解剖 学、生 物学及 现代科 学技术 基础上 、发展 起来的 一门以 “解剖 人、肉 体人” 为概念 的、新 兴的现 代医学 科学理 论体系 。主要 采用科 学实验 方法， 从宏观 到微观 ，直至 目前的 分子基 因层次 水平， 发展极 为迅速 ，超过 其它任 何一门 医学科 学，成 为世界 医学传统医学、基于“生 物-医 学模式 ”近代 发展起 来的西 医，20世纪西 医又发 展到“ 社会-心 理-生物 医学” （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr） 或综合 医学模 式，后 基因组 时代系 统生物 学的兴 起，（45传染 病q566丙肝964jo乙肝 28jgsx甲肝gh）形成 了系统 医学在 全球的 迅速发 展，成 为继传 统医学 、西医 学之后 中、西 医学汇 通的未 来医学 。当代 中国医 学类专 业比较 优秀的 学校有 北京大 学、（ 4f肿瘤fbb癌症 yuw3胃 癌d65i o肠癌.f2tr肺癌 65ff）
NOS
p7：5’-gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3’ p8：5’-tta tcc tag ttt gcg cgg ta-3’ (54 ℃)
CP4 EPSPS
p9：5’-ctt ctg tgc tgt agc cac tga
tgc-3’ p10：5’-cca cta tcc ttc gca aga ccc
可见中西医学，一个是以“功能人” 为概念 的独特 的哲学 医学理 论体系 ，一个 是以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 新兴的 现代医 学科学 理论体 系，二 者都不 是以完 整人为 研究对 象的科 学，从 理论讲 二者都 不是科 学的， 势必影 响各自 发展。 事实也 证明这 一切， 中医长 期停滞 不前、 疗效也 不确实 。西医 尽管发 展到目 前的基 因分子 层次， 但疾病 发病率 居高不 下，对 绝大部 分疾病 发病原 因认识 不清、 发病机 理弄不 明白， 治疗受 到制约 ，在小 小SAR S、禽 流感面 前竟束 手无策 ，在糖 尿病、 癌症、 心脑血 管疾病 、尿毒 症等相 当多疾 病面前 更是不 得不求 助或借 助中医 治疗。 一个是 疗效不 确实， 一个是 有些甚 至相当 多疾病 无法治 疗，这 就是中 西医学 结合的 缘由。 然而， 由于二 者是两 套理论 、两股 道上跑 的车， 风马牛 不相及 ，从理 论上讲 就没有 结合的 可能， 只是形 式上的 融合罢 了。故 出现西 医对治 疗不了 的疾病 只好求 助中医 ，而中 医则往 往采用 西医诊 断中医 治疗， 以及中 西治疗 法一块 用的局 面。
血球gdf55m白血球fd2），风马牛不相 及，从 理论上 讲就没 有结合 的可能 ，只是 形式上 的融合 罢了。 （df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）
故出现西医对治疗不了的疾病只好求 助中医 ，而中 医则往 往采用 西医诊 断中医 治疗， 以及中 西治疗 法一块 用的局 面。
（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr ）至于 （45传 染病q566丙肝964jo乙 肝28jgs x甲肝gh）循 证医学 、比较 医学、 后现代 医学、 行为医 学等所 谓“医 学”， 都称不 上一门 独立的 医学科 学，关 于这一 点在灵 魂医学 有关章 节中将 有相关 点评。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果
配制0.8％琼脂糖凝胶，取PCR产物5μL 加 1μL 点 样 液 混 合 后 点 入 上 样 孔 ， 于 120V电压电泳20~30min。电泳结束后， 用自动凝胶成像分析系统检测
M123456 7
M 1 234 5 6 7
内源基因(Lectin)特异性扩增 M12345 67
PCR假阴性结果 1． 模板问题 2． 试剂浓度不够 3． 标本中有Taq酶的抑制剂 4． PCR产物检测系统灵敏度不够
【注意事项】
1 提取高质量的模板DNA是PCR成功的 决定因素之一 2 注意防止试剂的交叉污染
五 结果处理
分析PCR产物电泳结果，判断所测样品是否含 转基因成分。
【思考题】
1、影响PCR反应效率的因素有哪些？ 2、为什么检测转基因大豆或者玉米时，以
PCR扩增检测转基因大豆、玉米
【实验目的】
通过PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米 产品是否含有转基因成分
培养学生的实验设计能力和创新能力
【实验原理】
以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin) 基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参， 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、 农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及 外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中的转 基因成分。
在治疗上，除了药物外，还有针灸、 推拿气 功、（df高血 压958心 脏病983u6糖 尿病87fr ）耳针 等特殊 疗法， 它是世 界传统 医学中 最完善 的一种 医学理 论体系 。它为 人类尤 其为中 国人民 （4f肿 瘤fbb癌 症 yuw3胃癌d65io肠 癌.f2tr肺 癌65ff）
健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血 球fd2）
华中科技大学、郑州大学等学校。 （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血 球fd2）
中医即中国传统医药学，是形成于数千 年前的 中国， 是建立 在人们 与疾病 长期斗 争的经 验总结 及阴阳 五行、 八纲脏 腑辨证 基础上 ，运用 朴素辩 证法及 思辨推 理方法 ，认识 机体、 自然、 疾病三 者关系 ，发展 起来的 （45传 染病q566丙肝964jo乙 肝28jgs x甲肝gh）一 门以“ 功能人 ”包括 功能脏 器为概 念的独 特的医 学哲学 理论体 系。（ df4肺炎 88gdg青霉素d25f肝 炎df6）
玉米 IVR
p3：5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc-
3’ p4：5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc-
3’ (56℃)
CaMV 35S
p5：5’-gat agt ggg att gtg cgt ca-3’ p6：5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’ (54 ℃)
本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上 每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成 产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经 25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
检测基因
大豆 Lectin
引物序列
p1：5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c3’
p2：5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg3’(54 ℃)