醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质

醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
一、实验目的：
掌握电泳的一般原理和醋酸纤维薄膜电泳的操作技术；
二、实验原理：
1、电泳：带电粒子在电场中向着与其电荷相反的方向泳动。

2、分类：按支持介质、电场强度、技术特点等分类。

支持介质：自由界面电泳；区带电泳：滤纸、醋纤薄膜、凝胶等。

3、基本原理---电荷效应：
F=Eq，f=6лrηv。

匀强电场中，F=f，v=Eq/6лrη。

在同一电泳条件下，混合物中不同组分将因其r和q的差异而具有不同的移动速度。

因此，电泳一定的时间（t），就可以互相分离。

通常使用“迁移率”（m）表示不同物质具有不同移动速度的特性。

m=V/E指在单位电场强度下带电颗粒的移动速度。

4、影响电泳的因素：
内在因素：样品本身所带净电荷、分子大小和形状。

外界因素：电场强度、缓冲液、支持介质。

5、血清蛋白的分离：
血清蛋白各组分pI≤7.5，缓冲液pH=8.6，净电荷为负电荷，向正极泳动。

由于各蛋白质成分的pI不同，所带电荷量q不同，加上分子半径大小r和形状的差别，依V=Eq／6πrη 可知，不同蛋白质成分向正极泳动的速度不同，电泳一定时间就可相互分离(Δd=Δv·t)。

分离后的蛋白质须经显色才能检测鉴定，通常用氨基黑10B 将血清蛋白质显色。

三、实验步骤：
1.泡膜洗净手，戴乳胶手套，取薄膜，于毛面距一端1.5 cm 处用铅笔轻画一直线。

小心将膜浮于巴比妥缓冲液上，待下面湿润后再将膜完全浸入，浸泡1小时。

2.仪器准备检查电源，接好电线（不通电），注意正负极。

加巴比妥缓冲液于电泳槽内，调整水平。

3.点样取出泡好的薄膜，用滤纸吸去多余的缓冲液。

毛面向上，于毛面膜
的一端画线处点样，注意点样量适当。

待样品渗入膜内后，将点样面翻转朝向下方（以防电泳时薄膜表面蒸发干燥），置于电泳槽的支架上，点样端放在负极。

4.电泳盖上电泳槽盖平衡 5 分钟。

然后检查电源正负极无误后通电，E= 15V/cm，电泳 60分钟后断电。

5.染色断电后将膜取出，浸入氨基黑10B 中5 分钟。

6.浸洗依次在三个洗脱皿中漂洗，每次5 分钟，至背景无色，区带清晰，
7.观察晾干，辨认结果。

四、结果与分析：
+ -
1 2 3 4 5
1.电泳结果如图所示，条带左侧为正极，右侧为负极。

2.区带数为5，根据电泳原理，从左（正极）到右（负极），依次为1：清蛋白，2：α1-球蛋白，3：α2-球蛋白，4：β-球蛋白，5：γ-球蛋白。

3.区带颜色的深浅和面积大小可以反应血清蛋白质的含量，颜色较深、面积较大者含量高。

由图可以看出清蛋白含量最多，含量第二高的是γ-球蛋白。

五、讨论
1.裁剪薄膜时要戴手套，防止污染薄膜，影响测量结果。

2.点样时血清不宜过多，若过多则条带过宽，可能会拖带，条带模糊看不清；也不易过少，过少则条带分离不完全。

无法清晰分辨。

3.点样端一定要放在负极，若放在正极，因净电荷为负，蛋白质会跑出条带，造成实验失败。

点样时若点样不均匀区带也会不均匀，区带不好看。

4.电泳时毛面一定要向下，因为电泳会产热，毛面含水分较少，若向上放置水分蒸发，蛋白质容易变性且不容易跑动。

5.漂洗次数过多或时间过长，都会造成条带看不清楚。

6.薄膜在染色时重叠紧密且时间很长或在缓冲液中浸泡的时间不足也会使区带分离效果不好。

六、结论
通过醋酸纤维薄膜电泳的方法，成功将血清蛋白质分离成五个区带：清蛋白，α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白，γ-球蛋白，且通过图谱粗略估计清蛋白含量最高，γ-球蛋白蛋白含量第二高，与实际情况相吻合。

七、临床意义
血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳可以作为疾病的初步诊断方法，某些严重的疾病通常可以导致CAME图谱发生明显变化，如图：。