四种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较

四种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较
袁亚婷;江岳鑫;尹小文;江兴堂
【摘要】背景:由于在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中对DNA造成的
损害,影响了后续的聚合酶链反应等研究.选择一种简便有效且经济实用的石蜡包埋
组织DNA提取方法成为研究者们关注和亟待解决的问题.目的:比较甲醛固定石蜡
包埋组织中4种提取DNA的方法对DNA质量的影响,探讨一种操作简便、污染少、经济实用的石蜡包埋组织中提取DNA的方法.方法:取手术切除的普通甲醛固定石
蜡包埋的非小细胞肺癌组织标本20例,分别以二甲苯脱蜡-酚氯仿法、改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法、试剂盒法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法提取其DNA,然后进行电泳分析、紫外分光光度计测定A260/A280比值及PCR扩增.结
果与结论:改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法
可获得较大的DNA片段,且两种方法与试剂盒法所提取DNA的A260/A280值相比较,均有显著性意义(P<0.05),4种方法的提取效率差异无显著性意义(P>0.1),以
改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法所得DNA为模板,扩增的目的条带亮度与阳性对照相当.结果证实改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法简便有效,所用试剂价格低廉,是一种经济
实用的石蜡包埋组织DNA提取方法.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2010(014)024
【总页数】5页(P4430-4434)
【关键词】甲醛;石蜡包埋组织;DNA提取
【作者】袁亚婷;江岳鑫;尹小文;江兴堂
【作者单位】厦门大学医学院,福建省厦门市,361004;厦门大学医学院,福建省厦门市,361004;厦门大学附属中山医院呼吸内科,福建省厦门市,361004;厦门大学附属
中山医院呼吸内科,福建省厦门市,361004
【正文语种】中文
【中图分类】R318
0 引言
甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin-embedded tissue，FFPET)具有便于运输，可长期保存等特点，是最常用的人类病历档案标本[1]。

随着分子生物
学技术的不断发展，石蜡包埋组织(paraffin-embedded tissue，PET)在医学检验、法医鉴定、大宗病例回顾性研究等方面的应用日趋广泛。

然而，FFPET在制作及
保存过程中，由于受到多种试剂和因素的影响，导致DNA脆性增加、DNA与蛋
白质交联等问题，为从FFPET中保质保量地提取DNA带来了困难[2-3]。

尽管如此，国内外已有很多文献对应用石蜡包埋组织成功提取DNA进行分子病理研究进行了报道[1,4-12]。

目前文献报道的从石蜡包埋组织中提取DNA的方法比较多，
为寻求一种简便有效、经济实用的从普通石蜡包埋组织中提取DNA的方法，作者参阅了近几年的相关文献[8，10，13-16]，结合已有的经验，将4种石蜡包埋组
织提取DNA的方法对DNA质量的影响作一对照研究。

1 材料和方法
设计：对比观察。

时间及地点：于2009-05/07在厦门大学附属中山医院开放实验室完成。

取材：随机选取厦门大学附属中山医院2006/2009手术切除的体积分数为10%
甲醛固定石蜡包埋非小细胞肺癌组织标本20例(由病理科提供)，无菌操作，每例
标本连续切取10 µm厚切片24片，每6片放入1个1.5 mL的灭菌Ep管中，共4组，80管。

主要材料：
试剂及仪器来源二甲苯、乙醇、醋酸钠、氯仿异戊醇、Tris-饱和酚、TES溶液(10 mmolTris-Hcl，1 mmol EDTA，0.5%SDS)、TET溶液(100 mmol Tris-Hcl，
1mmolEDTA，1%TritonX-100)、各种溶剂及化蛋白酶K(20 g/L)QIAamp DNA FFPE Tissue Kit Blood Genome DNA Extraction Kit、DNA聚合酶台式低温高
速离心机(5415R)数显电热恒温水浴槽(DK-8D)国药集团化学试剂有限公司或北京
天根生化科技有限公司美国罗氏德国QIAGEN公司TaKaRa公司紫外分光光度计(SmartSpec Plus)、凝胶成像分析系统(GEL DOC XR)、PCR仪(普通mycycler)电泳仪(DYY-8C)Eppendorf上海精宏实验设备有限公司BIO-RAD北京六一仪器厂
方法：
DNA提取方法：
方法1：二甲苯脱蜡-酚氯仿法。

步骤1：向装有组织切片的Ep管中加入1 mL二甲苯，振荡混匀10 s，室温全速离心2 min，弃上清，加入1 mL无水乙醇，充分混匀，室温全速离心2 min，弃上清。

打开Ep管盖，37 ℃孵育10 min，或直到残余乙醇全部挥发。

步骤2：在已脱蜡的组织切片管内加入500 µLTET溶液和30 µL蛋白酶K，37 ℃水浴过夜。

步骤3：在已消化过夜的组织中加入500 µL Tris-饱和酚，充分振荡，4 ℃ 13
000 r/min离心10 min，取上清，加入250 µL Tris-饱和酚、250 µL氯仿/异戊
醇(24∶1)，轻轻翻转10 min，4 ℃ 13 000 r/min离心10 min，取上清并加入1 mL预冷的无水乙醇及30 µL 3 mol/L NaAc，充分混匀，-20 ℃过夜。

4 ℃13 000 r/min离心15 min，弃上清。

向Ep管中加入1 mL体积分数为75%的乙醇，
轻轻翻转3 min，4 ℃13 000 r/min离心15 min，弃上清，室温干燥20 min或直至酒精完全挥发，加入50 µL TE缓冲液溶解DNA(-20 ℃保存)。

方法2：改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法。

步骤1：向装有组织切片的Ep管中加入1 mL TES溶液，充分振荡，70 ℃水浴30 min，再次振荡，4 ℃ 13 000离心15 min，弃上清。

重复该步骤共3遍。

步骤2：在已脱蜡的组织切片管内加入500 µL TET溶液和30 µL蛋白酶K，37 ℃水浴过夜。

步骤3：在已消化过夜的组织中加入500 µL Tris-饱和酚，充分振荡，4 ℃13 000 r/min离心10 min，取上清，加入250 µLTris-饱和酚、250 µL氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻翻转10 min，4 ℃13 000 rpm离心10 min，取上清并加入1 mL 预冷的无水乙醇及30 µL 3 mol/L NaAc，充分混匀，-20 ℃过夜。

4 ℃13 000 r/min离心15 min，弃上清。

向Ep管中加入1 mL体积分数为75%的乙醇，轻轻翻转3 min，4 ℃13 000 r/min离心15 min，弃上清，室温干燥20 min或直至乙醇完全挥发，加入50 µL TE缓冲液溶解DNA(-20 ℃保存)。

方法3：试剂盒法，按照试剂盒说明书操作。

步骤1：向装有组织切片的Ep管中加入1 mL二甲苯，振荡混匀10 s，室温全速离心2 min，弃上清。

加入1 mL无水乙醇，充分混匀，室温全速离心2 min，弃上清。

打开Ep管盖，37 ℃孵育10 min，或直到残余乙醇全部挥发。

步骤2：在已脱蜡的组织切片管内加入180 µL Buffer ATL和20 µL蛋白酶K(试剂盒自带)，充分混匀，56 ℃水浴1 h。

步骤3：90 ℃水浴1 h，短暂离心1.5 mL Ep管，迅速加入200 µL BufferAL和200 µL无水乙醇，充分混匀，短暂离心。

步骤4：小心转移全部消化物至QIAamp层析柱(放在2 mL收集管中) 中，盖上盖子，20 ℃8 000 r/min离心3 min，将柱子放入1个干净的收集管中，弃去原
先的收集管。

小心打开柱子，加入500 µL Buffer AW1，盖上盖子，20 ℃8 000
r/miin离心3 min，将柱子放入1个干净的收集管中，弃去原先的收集管。

小心
打开柱子，加入500 µL Buffer AW2，盖上盖子，20 ℃ 8 000 r/min离心3 min，将柱子放入1个干净的收集管中，弃去原先的收集管，20 ℃全速离心3 min，使
膜完全干燥。

步骤5：将柱子放入1个1.5 mL干净的Ep管(未提供)中，弃去原先的收集管。

小心打开柱子，加入50 µL Buffer ATE，室温下盖上盖子静置5 min，20 ℃全速离心1 min洗脱DNA(-20 ℃保存)。

方法4：改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法。

步骤1：向装有组织切片的Ep管中加入1 mL TES溶液，充分振荡，70 ℃水浴
30 min，再次振荡，4 ℃13 000 r/min离心15 min，弃上清。

重复该步骤共3遍。

步骤2：在已脱蜡的组织切片管内加入500 µL TET溶液和30 µL蛋白酶K，37 ℃水浴过夜。

步骤3：短暂离心1.5 mL Ep管，迅速加入200 µL BufferAL和200 µL无水乙醇，充分混匀，短暂离心。

步骤4：小心转移全部消化物至QIAamp层析柱(放在2 mL收集管中)中，盖上盖子，20 ℃ 8 000 r/min离心3 min，将柱子放入1个干净的收集管中，弃去原先的收集管。

小心打开柱子，加入500 µL Buffer AW1，盖上盖子，20 ℃ 8 000
r/min离心3 min，将柱子放入1个干净的收集管中，弃去原先的收集管。

小心打开柱子，加入500 µL Buff er AW2，盖上盖子，20 ℃ 8 000 r/min离心3 min，将柱子放入1个干净的收集管中，弃去原先的收集管，20 ℃全速离心3 min，使
膜完全干燥。

步骤5：将柱子放入1个1.5 mL干净的Ep管(未提供)中，弃去原先的收集管。

小
心打开柱子，加入50 µL Buffer ATE，室温下盖上盖子静置5 min，20 ℃全速离心1 min洗脱DNA(-20 ℃保存)。

DNA鉴定方法：
DNA质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定：取5 µL基因组DNA加1 µL 6×Loading Buffer混匀，5 µL从血液中提取的基因组DNA作为阳性对照，5 µL H2O作为阴性对照，Marker 5 µL同时上样，在1.0%的琼脂糖凝胶中以80 V电泳30 min，在紫外凝胶成像系统下观察所提取基因组DNA的电泳胶图。

DNA纯度鉴定及4种方法的提取效率比较：各取6 µL DNA样品，加水至60 µL 混匀后，装入分光光度计的比色杯中，先用60 µL去离子水校正零点，于260 nm 和280 nm处分别读出吸光度(A)值。

DNA的纯度根据A260/A280比值判断，纯度高的纯化DNA，其A260/A280在1.6～1.8之间，若比值高于1.8，说明DNA 样品中的RNA尚未除尽；若样品中含有酚和蛋白质，将导致比值降低。

各种提取方法的提取效率，用每种方法所得DNA的A比值在1.6～1.8之间的样品百分比
例计算。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增：人表皮生长因子受体(EGFR)外显子21，扩增片段长度为311 bp。

上游引物序列为：5’-TCG CCA GCC ATA AGT CCT CG-3’ ，下游引物序列为：5’-GGA AAA TGC TGG CTG ACC TAA AG-3’。

PCR体系为50 µL，其中含模板200 ng，10×PCR Buffer 5 µL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L) 4 µL，5 µmol/L上、下游引物各4 µL，1.25 u Pyrobest DNA Polymerase(TaKaRa)。

以血液提取的基因组DNA为模板作为阳性对照，以H2O为模板作为阴性对照。

PCR反应条件：95 ℃变性5 min，扩增
温度95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

PCR扩增产物的鉴定：取扩增产物5 µL和1 µL 6×Loading Buffer及Maker5Ⅰ
µL同时上样，经2.0%的琼脂糖凝胶电泳(100 V，25 min)，在紫外凝胶成像系统下观察PCR扩增产物的电泳胶图。

主要观察指标：4种方法提取的DNAA260/A280比值及PCR扩增结果。

设计、实施、评估者：实验设计为第一、二作者，资料收集、实施、评估均为第一作者，受过专业实验室操作训练。

统计学分析：对各组样品DNA的A260/A280值应用SPSS 13.0软件进行配对t 检验，对4种方法的提取效率进行卡方检验，P ＜ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果
2.1 四种提取方法的基因组DNA质量比较从基因组DNA的电泳胶图可以看出，从石蜡包埋组织中提取的基因组DNA，均有不同程度的DNA链降解，采用方法
1所提取的基因组DNA主要为小片段，集中在100 bp左右；方法3提取的
DNA片段集中在100～500 bp之间；采用方法2、4所提取的基因组DNA集中在250～1 500 bp范围内。

见图1。

Figure 1 Identification of genomic DNA from paraffin-embedded lung cancer tissues in 1.0% agarose gel图1 石蜡包埋肺癌组织中所提取基因组
DNA在1.0%琼脂糖凝胶中电泳的图谱
2.2 不同提取方法所提取基因组DNA的A260/A280比值及提取效率比较 4种方
法所得DNA的A260/A280比值在1.6～1.8之间的样品例数及其所占比例见表1，经卡方检验，4种方法获取高质量DNA的效率之间差异无显著性意义(P ＞ 0.1)。

表1 不同方法的提取效率比较Table 1 Efficiency comparison of the four methodsMethod 1: xylene dewaxing and phenol-chloroform method; method 2:improved TES dewaxing with water-bath and phenol-chloroform method;method 3: genomic DNA extraction kit; 4: improved TES dewaxing with water-bath and genomic DNA extraction kit; method 4: improved
TESdewaxing with water-bath and genomic DNA extraction kitA260/A280 Method 1 Method 2 Method 3 Method 4 (1.6-1.8 7 35)n Percentage 8 40 2 10 7 35
4种方法所得DNA的A260/A280值见表2。

经t 检验，方法2和方法4分别与
方法3所提取DNA的A260/A280值相比较，差异均有显著性意义(P ＜ 0.01)，方法2与方法4比较，方法1与另外3种提取方法相比较，其所得DNA的A比
值差异均无显著性意义(P ＞ 0.05)。

表2 不同提取方法所得DNA的A260/A280值Table 2 A260/A280 of DNA obtained by four methodsMethod 1: xylene dewaxing and phenol-chloroform method; method 2:improved TES dewaxing with water-bath and phenol-chloroform method;method 3: genomic DNA extraction kit; 4: improved TES dewaxing with water-bath and genomic DNA extraction kit; method 4: improved TES dewaxing with water-bath and genomic DNA extraction kitNo. Method 1 Method 2 Method 3 Method 4 1 1.68 1.56 1.87 1.87 2 1.68 1.72 1.91 2.00 3 1.56 1.71 1.92 1.85 4 1.78 1.70 1.95 1.88 5 1.68 1.80 1.98 1.88 6 1.79 1.75 1.89 2.13 7 2.07 1.62 1.53 1.84 8 2.15 1.45 1.92 1.88 9 1.82 1.91 1.95 1.74 10 1.83 1.80 1.85 1.56 11 1.88 1.94 1.98 1.72 12 1.89 1.97 2.00 1.53 13 1.70 1.90 1.97 1.66 14 1.90 1.60 1.73 1.55 15 1.84
1.57 1.95 1.86 16 1.62 1.56
2.36 1.68 17 1.83 1.92 1.74 1.74 18 1.88 1.53
1.97 1.69 19 1.84 1.50
2.26 1.75 20 1.94 1.49 2.00 1.59
2.3 不同方法所提取DNA为模板的PCR扩增情况 4种方法所提取的基因组DNA 均可扩增出目的条带，方法1所提DNA模板扩增出的目的条带最淡，几乎看不出；另外3种方法所得DNA为模板扩增出的目的条带清晰，方法2所提DNA模板扩增出的目的条带亮度与阳性对照相当。

见图2。

Figure 2 Obtained DNA was aplified by RCR with primer of 311 bp EGFR exon 21 in 2.0% agarose gel图2 不同方法所得DNA以311bp EGFR外显子21引物扩增结果在2.0%琼脂糖凝胶中的电泳图谱
3 讨论
在病理学研究中，甲醛作为固定液已经有100多年的使用历史[17]，甲醛是福尔马林固定液中的主要成分，它在发挥固定组织作用的同时，也对DNA分子产生不利影响，导致DNA链的脆性增加，同时石蜡包埋组织中DNA与蛋白质之间形成牢固的复合物，阻碍蛋白酶对组织的消化，进而影响FFPET的DNA提取[3]。

近年来，关于石蜡包埋组织DNA提取的方法研究较多，其中包括一步法[18]、酚氯仿抽提法[8]、氯化钠盐析法[1,19]、试剂盒法等，可能由于所用标本组织类型、保存时间及具体实验操作方法的差异，导致各研究结论并不一致。

本文在已有的研究结果基础上，从DNA提取的数量及质量上对4种石蜡包埋组织DNA提取方法进行比较，由以上结果可以看出，4种方法所提取的基因组DNA 均有不同程度的DNA链降解，但方法2、4所获得的基因组DNA质量较高，含有较完整的片段，而方法1、3所得DNA降解相对比较严重，说明传统的二甲苯脱蜡方法虽然脱蜡较为彻底，但更容易导致DNA链降解，而且二甲苯是一种有毒的有机溶剂，对操作者和环境造成不良影响。

而TES溶液中0.5%的SDS有较强的脱蜡作用[10]，其中的Tris及EDTA均可对DNA起到保护作用，另外，TET溶液中的Triton X-100是一种强的非离子表面活性剂，无变性作用，容易使细胞膜溶解，且较低浓度不会抑制PCR反应，从而提高DNA获得率及PCR的反应效率[20]。

从所得DNA的纯度分析，方法2和方法4明显优于方法3，试剂盒法所提取DNA的A260/A280值过高(1.94±0.17)，说明试剂盒法所得DNA中混有较多的RNA，从而影响了DNA的纯度。

而从获得高质量DNA的提取效率分析，4种方
法的提取效率差异无显著性意义。

由以上分析可以看出，不论是从所获取DNA的质量还是提取效率方面来看，方法2和方法4均没有明显差别，但相比较而言，方法4所用试剂盒价格昂贵，而且如果脱蜡或组织消化不彻底，会堵塞层析柱，从而影响到DNA的提取。

而改良TES水浴脱蜡-酚氯仿抽提DNA法所获得的基因组DNA质量好，所用试剂价格低廉，提取效率高，更适合大样本的实验研究，是一种值得推荐的污染相对较少，且简便有效、经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法。

4 参考文献
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