发酵——种子的扩大培养
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目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
✓ 培养时间为5~14天。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子。
试管→三角瓶→摇床→种子罐
2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
常用微生物发酵级数：
✓ 细菌：二级发酵 茄子瓶→种子罐→发酵罐
✓ 霉菌：如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发
芽）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时）→发酵罐 ✓ 放线菌：四级发酵
✓ 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子
4、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
3、起始接种物的传代问题 细菌 保藏斜面 → 活化斜面 产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。
原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性 蛋白酶，12小时最好。
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH，产物生成量 酶活等
单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐， 有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色 力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情 况好。 无污染
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
一级种子质量要求
种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上
残糖：0.5％以下 无菌检查：(-)
噬菌体检查： (-)
镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。
大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
0.025% 0.015%
薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
3、发酵级数的确定 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，
工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
发酵——种子的扩大培养
种子扩培的目的 接种量的需要
菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平 种子的要求： 总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
第一节 种子制备过程举例 一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程 斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养
2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因:
一是成本
二是驯化
例：柠檬酸发酵 以蔗糖为原料
成分
麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
接种后培养液的体积
过大过小都不好，以实践定，如大多数抗生素为 7-15%。但是一般认为大一点好。 通常接种量：细菌1~5%，酵母菌5~10%，
霉菌7~15%，有时20~25%
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
5、种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。
革兰氏阳性反应
3. 二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
通风量: 50L种子罐1:0.5,搅拌转速340r／min；
250L种子罐1:0.3,搅拌转速300r／ min 500L种子罐1:0.25,搅拌转速230r／ min
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种 子，但操作繁琐。
➢ 获得一定数量和质量的菌丝体 便于操作，但需要更仔细的控制。
例：放线菌孢子的制备
✓ 采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨和一些无机盐等。
✓ 培养温度一般为28˚C。
培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
三、啤酒酵母的扩大培养
三级扩大培养
扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍 第2级到第3级为4-6倍
1，实验室扩大培养
2，车间扩大培养
接种方式： 从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛 无菌检查
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
从种子罐接种：
种子的质量要求
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
第二节 种子制备的技术概要 一、种子制备的过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验
室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因 此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段
感谢聆听！
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸镁0.04% pH7.0
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
✓ 培养时间为5~14天。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子。
试管→三角瓶→摇床→种子罐
2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
常用微生物发酵级数：
✓ 细菌：二级发酵 茄子瓶→种子罐→发酵罐
✓ 霉菌：如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发
芽）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时）→发酵罐 ✓ 放线菌：四级发酵
✓ 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子
4、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
3、起始接种物的传代问题 细菌 保藏斜面 → 活化斜面 产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。
原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性 蛋白酶，12小时最好。
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH，产物生成量 酶活等
单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐， 有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色 力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情 况好。 无污染
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
一级种子质量要求
种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上
残糖：0.5％以下 无菌检查：(-)
噬菌体检查： (-)
镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。
大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
0.025% 0.015%
薯干粉
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
3、发酵级数的确定 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，
工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
发酵——种子的扩大培养
种子扩培的目的 接种量的需要
菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平 种子的要求： 总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
第一节 种子制备过程举例 一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程 斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养
2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因:
一是成本
二是驯化
例：柠檬酸发酵 以蔗糖为原料
成分
麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
接种后培养液的体积
过大过小都不好，以实践定，如大多数抗生素为 7-15%。但是一般认为大一点好。 通常接种量：细菌1~5%，酵母菌5~10%，
霉菌7~15%，有时20~25%
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
5、种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。
革兰氏阳性反应
3. 二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
通风量: 50L种子罐1:0.5,搅拌转速340r／min；
250L种子罐1:0.3,搅拌转速300r／ min 500L种子罐1:0.25,搅拌转速230r／ min
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种 子，但操作繁琐。
➢ 获得一定数量和质量的菌丝体 便于操作，但需要更仔细的控制。
例：放线菌孢子的制备
✓ 采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋 白胨和一些无机盐等。
✓ 培养温度一般为28˚C。
培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
三、啤酒酵母的扩大培养
三级扩大培养
扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍 第2级到第3级为4-6倍
1，实验室扩大培养
2，车间扩大培养
接种方式： 从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛 无菌检查
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
从种子罐接种：
种子的质量要求
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
第二节 种子制备的技术概要 一、种子制备的过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验
室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因 此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段
感谢聆听！
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸镁0.04% pH7.0