5种除草剂对油菜ALS酶活性的影响及杀雄作用评价

5种除草剂对油菜ALS酶活性的影响及杀雄作用评价
刘志权;刘茜琼;于澄宇;胡胜武
【摘要】在油菜杂种优势利用中，为筛选新型化学杀雄剂，有效诱导雄性不育，以甘蓝型油菜自交系740C和Q8C为材料，使用5种除草剂（苯磺隆、氯吡嘧磺隆、环氧嘧磺隆、双草醚和阔草清），各4个稀释浓度（1／200、1／100、3／200、1／50）对现蕾期的植株进行喷施，在处理后1至4d分别采取油菜叶片和花蕾，测定乙酰乳酸合成酶（acetolac-tate synthase，ALS）酶活性，并在后期进行花粉活力的测定和育性分析。

结果表明：双草醚、阔草清能够抑制ALS酶的活性但不具有化学杀雄作用。

同一药剂不同浓度处理的油菜体内ALS酶活性表现为随药剂浓度升高而降低的趋势。

740C比Q8C对5种除草剂更敏感，ALS酶活性抑制程度更明显。

老叶、幼叶、花蕾对化学杀雄剂的敏感程度依次增加，其ALS酶活性逐步降低。

筛选出氯吡嘧磺隆和环氧嘧磺隆，可以作为候选化学杀雄剂，适合浓度分别是1．3～2．6mg／L和1．5～3．0mg／L。

%Chemical hybridization agent is used to induce male sterility which is one of the effective ways to uti-lize rapeseed heterosis.To select better herbicide as chemical hybridizing agent in fields,5 herbicides were studied which inhibited rapeseed acetolactate synthase (ALS).5 herbicides including tribenuron-methyl,halosulfuron-methyl,oxasulfuron,bispyribac-sodium,and flumetsulam,were sprayed on Brassica napus inbred lines 740C and Q8C at bolting stage.Each herbicide was tested in 4
concentrations:1/200,1/100,3/200 and 1/50 of the bench-mark concentrations respectively.In vivo enzyme activities of ALS were assayed from leaves and buds collected dur-ing 1 -4 d after spray.Pollen viability
was tested.Results showed that bispyribac and flumetsulam inhibited ALS activity without gametocidal effect.ALS enzyme activities of treated plants under different herbicide concentrations decreased with concentrations.740C was more sensitive than Q8C.The decrease of ALS activity was more promi-nent.ALS activities decreased gradually in old leaves,young leaves and flower buds,which indicated the increase of sensitivity.Halosulfuron and oxasulfuron could be used as potential chemical hybridizing agents on rapeseed un-der 1.3 to 2.6mg/L and 1.5 to 3.0mg/L respectively.
【期刊名称】《中国油料作物学报》
【年(卷),期】2016(038)006
【总页数】8页(P742-749)
【关键词】化学杀雄剂;甘蓝型油菜;ALS酶;花粉活力;雄性不育
【作者】刘志权;刘茜琼;于澄宇;胡胜武
【作者单位】西北农林科技大学农学院，陕西杨陵，712100;西北农林科技大学农学院，陕西杨陵，712100;西北农林科技大学农学院，陕西杨陵，712100;西北农林科技大学农学院，陕西杨陵，712100
【正文语种】中文
【中图分类】S565.403
乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS，EC4.1.3.18，或 acetohydroxy acid synthase，AHAS），是植物和微生物体内合成支链氨基酸
（branchedchain amino acid，BCAA，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）途径的首
要限速酶［1］，是核基因编码、定位于高等植物叶绿体中的一种蛋白。

由于它是多种除草剂和生长抑制物质的作用靶标［2～7］，只存在于植物和微生物中，因
此ALS酶抑制型农药对人畜比较安全。

Yu等［8，9］发现小麦田使用的某些除草剂可导致油菜生长抑制或雄性不育，由此试验筛选出几种活性成分为磺酰脲类除草剂的油菜化学杀雄剂（CHA），将成本低廉和来源广泛的除草剂用作化学杀雄剂，扩大了用途。

目前国内正在广泛使用的油菜CHA均以磺酰脲类超高效除草剂为主要活性成分，并添加不同助剂形成水分散颗粒剂、水剂、可湿性粉剂、油乳剂等剂型［10］。

近年来，公开报道的化学杀雄剂主要有BHL、EN、EXP、ESP、GS－1、化杀灵、定军一号、苯磺隆、酰嘧磺隆、SQ－1、SX－1、单嘧磺酯钠等，但
由于化学杀雄剂的效果受品种、植株大小、温度、湿度、喷药量、喷施方法、处理时期等因素影响较大，同时考虑制种成本及环境保护的要求，国内外能够真正大面积推广应用的高效、环保低毒、廉价、适用范围广的化学杀雄剂仍少之又少，化学杀雄剂喷施效果的早期快速鉴定及新型化学杀雄剂的筛选仍是目前亟待解决的问题。

本文选择2种磺酰脲类除草剂氯吡嘧磺隆、环氧嘧磺隆和2种非磺酰脲类的ALS
抑制剂双草醚、阔草清，并以苯磺隆［8，11］作为对照进一步筛选新型化学杀雄剂并制定合理的喷药剂量。

前4种药剂相关的合成工艺路线、结构特性前人已有
相关报道［12～15］，但作为油菜化学杀雄剂的研究尚未见报道，特别是这几种
除草剂对ALS酶活性变化的研究及对田间适宜喷药量的快速鉴定目前还需要开展
研究。

本文对除草剂化学成分、油菜品种基因型、不同组织部位、不同喷药时间等因素对于杀雄效果以及对ALS活性的影响予以分析，旨在为正确使用化学杀雄剂
提供参考，为大面积推广提供候选药剂。

1.1 材料
甘蓝型油菜品种740C（浅薄叶片自交系）和Q8C（深厚叶片自交系）均为本实验
室保存。

除草剂苯磺隆购自上海杜邦农化工有限公司，氯吡嘧磺隆购自寿光原野化学有限公司，环氧嘧磺隆购自湖北巨胜科技有限公司，阔草清购自美国陶氏益农公司，双草醚由江苏省激素研究所金坛有限公司提供。

1.2 试验处理
于2014年至2016年油菜生育期进行试验。

每处理重复3次。

每小区种植3行约45株，行长2m，行距0.50m，株距0.13m（折合每公顷150 000株）。

除草剂以推荐有效成分剂量配制原始母液，使用前每个药物按基准剂量，配制1／200、1／100、3／200、1／50等不同浓度稀释液（表1），喷施前加入约0.2% ～0.5%洗衣粉以增强药液在叶片表面的吸附性能。

在现蕾期（最长花蕾约2～3mm，其
最大小孢子发育处于单核期）用小型手动喷雾器叶面喷施稀释液，每株受药量控制在8～10mL，均匀喷湿叶片及花序。

对照用添加助剂的水溶液喷施。

1.3 ALS活性的活体（invivo）测定
在油菜现蕾期，用超微量不同浓度ALS抑制剂处理。

ALS的in vivo分析主要参考Simpson等［16］从Gerwick［17］快速测定法调整而来的方法，并进行修改。

每处理分期（1、2、3、4 DAT，day after treatment）选取部分植株再喷施
0.5mmol／L环丙二羧酸（1，1 －CPCA），1，1－CPCA是BCAA合成途径ALS后续的酮醇酸还原异构酶（KARI）的特异抑制剂，由此可以完全抑制ALS酶的后续反应，导致ALS酶催化产物乙酰乳酸积累［16］。

24h后，每样品取
0.2～0.5g，加提取液（0.5mol／L Tris－Cl，pH7.5或 0.1mmol pH7.5磷酸盐
缓冲液）4mL，研磨，8 000r／min离心10min，取上清液2mL（空白对照为水），60℃水浴10min，加入50μL的1mol／L硫酸，60℃保温30min脱羧生
成acetoin。

然后分别加入0.5%（m／V）肌酸（creatine，2mol／L NaOH配制）、5%（m／V）α－萘酚溶液（2mol／L NaOH配制）各0.5mL，37℃避光反应30min，使acetoin结合形成红色复合物，5 000r／min离心1min除去浑
浊，上清液用分光光度计在530nm波长下比色，1个OD定义为一个ALS酶单位。

然后根据测量的OD值，对相同条件下处理／对照比值进行分析，以百分数
表示，并作曲线图。

1.4 油菜育性及结实性调查
花粉活力观察：喷药10d后，取可育、不育、半不育的油菜花蕾进行醋酸洋红染
色分析育性。

取成熟花药，捣碎后轻轻挤压释放花粉，用1%醋酸洋红水溶液染色，在显微镜下观察花粉活力。

正常花粉颗粒染色深而外形完整，败育的花粉不能染色，或染色浅，或外形不规则破裂。

单株育性调查：从初花至终花，每隔2～3d调查，统计全不育、半不育和可育等
各类植株数量。

以肉眼观察花器形态确定植株育性。

全不育株：全株花朵不育，雄蕊退化成针状，花药干瘪，无活花粉。

半不育株：主花序及部分分枝花朵不育。

可育株：花器正常。

结实性统计：对效果较好的浓度处理，随机选取10个植株套袋，每日拍打促进授粉，观察自交结实率。

另选取10株，用纸袋套5～6个分枝进行人工控制授粉，
计算结实率（代表雌性育性）。

成熟期分别调查相对于对照的自交结实率和人工授粉结实率。

处理和对照每个分枝均随机取10个角果，统计总结实粒数，作为处理结实量和对照结实量。

相对结实率（%）＝（处理结实量／对照结实量）×100。

2.1 老叶、幼叶、花蕾之间ALS酶活性的比较
5种除草剂抑制740C的ALS酶活性因种类而异（图1，以1／50最高浓度处理
为例，其他浓度处理均有相同趋势）。

花蕾 ALS酶活性最低，其次是幼叶、最后
是老叶。

苯磺隆、氯吡嘧磺隆、环氧嘧磺隆处理后的油菜花蕾、幼叶的ALS酶相
对活性范围在20%～40%，而双草醚、阔草清处理下ALS酶相对活性范围在40%～60%。

2.2 740C和Q8C的ALS酶活性比较
通过田间调查发现，双草醚、阔草清不具有诱导雄性不育的效果，但植株长势均受到明显的抑制，且随着浓度增大抑制作用增强，相同浓度的双草醚对油菜长势的抑制作用明显强于阔草清，其中用双草醚的1／50稀释浓度处理的740C植株生长
停滞，约25d后才缓慢恢复生长，但植株花期始终保持可育状态。

仅有苯磺隆、
氯吡嘧磺隆、环氧嘧磺隆对油菜具有化学杀雄作用，因此对740C和Q8C两个品
种分别在这3种候选化学杀雄剂的1／100稀释浓度梯度作用下测定ALS酶活性。

由图2可知，两个品种对药剂的敏感程度差异明显。

品种Q8C对苯磺隆、氯吡嘧磺隆、环氧嘧磺隆的敏感程度均小于740C，即这3种化学杀雄剂对740C的ALS 酶活性影响均更大，尤其是花蕾和幼叶酶活性受到更强的抑制。

2.3 CHA处理浓度与ALS酶活性的关系
考虑到花蕾是对化学杀雄剂（CHA）最敏感的部位，也是CHA作用的关键部位，我们把花蕾ALS酶活性随CHA浓度的变化关系进行回归分析。

回归直线斜率均为负数，即ALS酶活性与浓度梯度呈现负相关（图3）。

环氧嘧磺隆处理的决定系
数R2＝0.765，相关性极显著。

苯磺隆、氯吡嘧磺隆处理的数据则相对分散，R2
分别为0.546 5和0.542 7，相关性不显著。

但该结果初步显示有可能以ALS活性来指示喷药量的多少。

同时可以初步通过ALS酶活性的受抑制程度来判断化学杀
雄剂的喷施效果，结合田间性状调查结果，酶活性受抑制超过50%，即稀释浓度
大概超过1／100时，会对植株的生长造成较严重的影响，产生明显药害。

2.4 氯吡嘧磺隆和环氧嘧磺隆的药效评价
在花期分别采取有代表性的油菜花朵进行醋酸洋红染色，以环氧嘧磺隆处理的
740C为例（图4），其中A为对照的花粉（能够被染成红色），B、C分别为半
不育株（不能染成红色的和能够染色的花粉粒都可观察到）和不育株的花粉（不能染成红色），符合田间的育性调查结果。

在显著性水平为0.05的条件下进行显著性分析（表2）。

相对于CK，苯磺隆、氯
吡嘧磺隆、环氧嘧磺隆3种化学杀雄剂均可诱导90%以上的全不育株率，败育彻底；其天然结实率因浓度、药品不同而差异较大，其中氯吡嘧磺隆、环氧嘧磺隆1／100浓度处理的天然结实率基本都可以满足制种的要求，田间性状调查也发现
药害较轻。

这两个品种用苯磺隆处理后天然结实率均不高，根据田间农艺性状调查，药害均比较明显，叶片大面积发紫或有黄斑、落蕾严重，推测是品种敏感性及浓度偏高的问题。

3.1 化学杀雄剂处理对酶活性的影响
本文发现甘蓝型油菜对除草剂处理的响应因基因型而异。

前人研究表明，主要是ALS的敏感性差异和谷胱甘肽巯基转移酶GSTs等对除草剂的解毒代谢差异导致的［18］。

最近的研究从分子水平验证了ALS酶基因的表达量变化及突变可以影响
对除草剂的抗性［19～22］。

对于同一植株的不同部位来说，老叶、幼叶、花蕾
新陈代谢活动依次增强，支链氨基酸的合成能力也逐步提高，当喷施化学杀雄剂时，受到的抑制作用也更强，这与前人研究基本一致［23～26］。

酶活性变化的主要
原因是当喷施化学杀雄剂后，这些内吸性除草剂在油菜体内有一个吸收传导的过程，大概3～4d酶活性达到最低值，之后缓慢恢复正常［1］。

尽管都有这种活性变化趋势，ALS具体数值会受药剂化学结构、油菜品种、植株大小、天气、喷药剂量
的影响。

最主要的因素是不同化学结构药剂在不同组织的药效持续时间不一样，这和药物的半衰期或者说植株不同组织对药物的消减程度（代谢解毒能力）有关。

双草醚、阔草清能对油菜不同组织的ALS酶活性产生抑制作用，但却不具有化学杀
雄的效果，说明ALS酶活性的受抑制只是导致除草剂产生化学杀雄效果的必要条件，同时还与化学除草剂的结构特征、作用机理等存在很大的关系。

我们也推测ALS酶抑制剂产生杀雄效果可能还与小孢子发育、绒毡层发育有关基因的表达抑
制程度有关［27］。

3.2 根据invivoALS酶活性预测化学杀雄剂处理效果
阻碍油菜化学杀雄剂推广应用的一个主要限制因素是在不同年份、气候、长势、品种等复杂情况下喷药者对喷药剂量的准确把握。

笔者做了两年三批次的化学杀雄剂的筛选实验，仍然很难确切把握适合具体品种、植株大小所对应的浓度及喷药量。

根据笔者团队对其他品种和其他化学杀雄剂的筛选结果，喷施药量以除草剂基准浓度（一般为小麦、水稻田等推荐剂量）的1／200～1／100为宜［10］。

同时，
以往研究都侧重于从花瓣的大小及直径、柱头长短的变化、结实率、植株育性及高度变化等田间农艺性状评价化学杀雄剂的效果，这些指标对于CHA的实验技术至关重要，但是要获取这些评价指标基本在药效发挥的中后期及结实期，对于CHA
喷药量及喷药效果的预测无能为力，若发生药害或喷药量不足，若此时再进行补救措施，如喷施解毒剂、安全剂或者补喷CHA均为时已晚。

因此如何快速鉴定喷药效果成了当前亟待解决的问题。

近年来有不少通过测ALS酶活性研究植株对除草
剂抗性的快速鉴定方法，说明这也是一个行之有效的方法［28，29］。

可以结合
近红外光谱技术对喷药后ALS酶的活性进行无损检测［30］。

再结合早期的田间
农艺性状的调查指标，包括中下部老叶片、中上部幼叶颜色的变化、茎及一级分枝是否发紫、落蕾情况就基本可以预判喷药后的杀雄及药害效果。

本文试图在喷药早期活体测定ALS酶活性来预测喷药量是否达到杀雄剂的合理范围，同时也通过比
较对照与处理组之间的差异来进行快速鉴定，但建立对应于不同药剂、不同品种、不同生物量、ALS酶的活性与喷药剂量的函数关系则比较复杂，需要建立品种特性、植株大小、温度、湿度、ALS酶活性、药剂吸收量等因素之间的多年份统计
数据关系才能得到更为精准的剂量，这有待于进一步研究。

试验结果发现喷施5种ALS酶活性抑制类化学除草剂后，ALS酶活性在不同品种、不同药剂、不同浓度及喷施后时间有不同的表现。

初步发现可以通过检测喷施化学杀雄剂4d之内测定ALS酶活性进行喷药效果的早期预测。

甘蓝型油菜自交系
740C比Q8C对本实验筛选出来的化学杀雄剂更敏感。

其中环氧嘧磺隆、氯吡嘧
磺隆可以作为应用于大田的候选化学杀雄剂。

但对于不同地区、不同气候、不同品种、不同田间水肥条件，应先进行小面积的试验，确立相应的技术方法体系后再进行大面积的推广应用。

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