膳食纤维分析方法的研究

华南理工大学学报(自然科学版)
第24卷第12期Journal of South China University of Technology Vol.24No.12 1996年12月(Natural Science)December1996膳食纤维分析方法的研究3
郑建仙　孙由芳
(华南理工大学轻化工研究所)
摘　要 对Selvendran R R等人提出的冷中性洗涤剂纤维(CNDF)提取法作了改良。

经化学分
析与电镜观察表明,改良法的纤维提取效果与原推荐法相一致。

由于改良法省去了湿球磨与超声
波处理阶段,因此更显得方便与实用。

关键词　冷中性洗涤剂纤维;膳食纤维;湿球磨;超声处理
中图资料分类号　TS20713
膳食纤维的分析是依据重量差进行的,其原理是用适当的溶剂或酶溶解待测样品中的蛋白质与淀粉而将之去除掉,所得残渣称为细胞壁物质(CWM),它由膳食纤维(DF)和灰分两部分组成。

扣除灰分所得膳食纤维重量与待测样品重量的百分比值即为该样品的膳食纤维含量。

因此,膳食纤维分析的关键在于对细胞壁物质进行完整而又没有损失的提取。

膳食纤维(细胞壁物质)是由果胶、果胶类物质、半纤维素、纤维素和木质素等组分组成。

由于这些复杂组分往往是纵横交错地紧密结合在一起,要从各种富含蛋白质或淀粉的原料中完整彻底而又没有损失地分离出细胞壁物质是很困难的。

目前已有的各种方法,没有一种能够完全满足上述要求[1]。

本文作者在参考文献资料、综合对比各种方法优缺点的基础上,最后选择Selvendran R R 等人提出的冷中性洗涤剂纤维(CNDF)提取法进行改良,得到一种简化的新分析方法。

1　材料与方法
111　试验对象
豆皮(SB),市售大豆人工干法剥皮,皮约占整粒大豆重量的7%;豆渣(SR),干法脱皮后的大豆按常规方法进行磨浆分离而得。

112　改良的CNDF提取法
参见图1,分别将干燥粉碎过的豆渣与豆皮混匀于含5mmol/L焦亚硫酸钠、w=1%的SL S(十二烷基硫酸钠)溶液中,置于冰箱内保持2℃并不时搅拌;22h后用1000r/min的冷冻离心机处理20min,分离出残渣R1,去离子水洗涤两次后分散于20℃的PAW(苯酚∶醋酸冰∶水=2∶1∶1)中保持40min,再次离心得残渣R2。

两次离心所得上清液分别透析(透析袋截留分子量10000,SL S处理液对水透析,PAW处理液对250ml/L的醋酸液透析)后冷冻干燥之,
来稿日期:1995211225
3中国博士后科学基金、广东省自然科学基金和广东省博士后科学基金资助项目
郑建仙,男,1966年生,副教授,博士后;主要研究方向:功能性食品。

华南理工大学轻化工研究所,邮编: 510641
用来分析被溶解的那部分可溶性膳食纤维。

图1　细胞壁物质(CWM )的分离简图
Fig.1　Fractionating diagram of cell wall material (CWM )
残渣R 2用去离子水洗涤后分散于20℃、
φ=90%的DMSO (二甲基亚砜)溶液中,不断搅拌保持22h ;离心得残渣R 3,洗涤后装入透析袋中对水透析15h 以去除所吸附的微量DMSO 。

依次将R 3分散于含有糖化酶和胰酶制剂(pancreatin )的20mmol/L PO 4/10mmol/L NaCl 缓冲液中(p H =7),恒温37℃保持24h 和17h 。

离心洗涤后所得物料经I 2/KI 呈色显阴性,表明为纯净的细胞壁物质,即膳食纤维。

113　常规化学成分分析[1]
蛋白质(N ×6.25)AACC 46211;脂肪AACC 30210;粗纤维AACC 32210;灰分AACC 08201;水分AACC 44215A 。

114　透射电镜拍照
待拍样品放在锇酸(OsO 4)中固定后经磷酸盐缓冲液(p H =7.2)漂洗过夜,再用戊二醛固定后经磷酸盐缓冲液再次漂洗,依次用φ=50%、70%、90%、100%乙醇脱水,最后用环氧丙烷脱水;将完全脱水的样品包埋在环氧树脂中,经梯度烘干后即可超薄切片,再经醋酸铀和柠檬酸铅双染色后上电镜观察拍照。

2　结果与讨论
211　对膳食纤维分析方法的简单评述
已报道的有关提取分析植物中膳食纤维的方法很多,大致可分为溶剂法和酶法两大类。

出于所用溶剂和提取条件的不同,两大类中又有很多种具体方法,如溶剂法中比较著名的有Southgate D A T 的醇不溶纤维提取法(A IR )[2]、Van Soest P J 的热中性洗涤剂纤维提取法(NDF )[3]和Selvendran R R 的冷中性洗涤剂纤维提取法(CNDF )[4,5]等。

其目的都在于最大限度地除净原料中的蛋白质与淀粉成分,同时又不能破坏非淀粉质碳水化合物与木质素(膳食纤维)的存在与性质。

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Southgate D A T 的A IR 法易于操作,对淀粉和蛋白质含量不太多的果蔬类物料比较适宜,该法的主要缺点是伴随有沉淀现象。

其原因有两个方面:(1)原料中所含的淀粉不溶于醇溶液,淀粉颗粒间会因强烈的氢键结合力导致沉凝现象出现;这种发生了沉凝并伴随沉淀下来的淀粉不易被淀粉酶作用,也很难溶解于DMSO 溶剂中。

(2)醇处理的结果很可能通过氢键作用力使得细胞壁多糖与细胞间蛋白质发生强烈的相互作用,从而改变它们各自的特性;伴随沉淀下来的蛋白质不易被蛋白酶所分解,也较难溶解于PAW 之类无机溶剂中。

有鉴于此,该法会使分析数据偏大。

但自1969年问世以来,已出现了几种类似的改良方法。

Van Soest P J 的NDF 法对去除细胞间的蛋白质很有效,主要缺点在于会损失一定数量的果胶类物质和半纤维素,同时也不能完全去除淀粉[6]。

此外,用热洗涤剂处理后,淀粉变成很粘稠的溶胶,过滤和离心分离较困难,即使使用Van Soest P J 推荐的过滤助剂,也难以解决问题[6]。

改良的方法包括使用双倍的洗涤剂和淀粉酶等。

Selvendran R R 推荐的冷中性洗涤剂法,实践证明是一种较完善的方法。

被过量溶解而损失的少量冷水溶果胶类物质与半纤维素,可以从溶剂中加以回收[5]。

使用冷洗涤剂提取的残渣很容易用离心或过滤方法分离开。

酶法分析的原理是用蛋白酶和淀粉酶分解去除物料中的蛋白质与淀粉,所用的酶通常有两种,即胃蛋白酶(pepsin )和胰酶制剂(pancreatin )。

Hellendoorn E W 等人最先提出这种方法[6],然而由于细胞结构未被打破或其它原因,该法尚不能完全降解淀粉和蛋白质。

虽然Hellendoorn E W 等人声称这种分析法更接近于人体正常生理条件下的不消化物质,更符合膳食纤维的定义,然而附和的人并不太多。

为了克服上述缺点,一些人提出通过改变反应条件以求更完全地降解淀粉和蛋白质的方法。

有代表性的主要有Honing and Rackis 和Asp and Jo 2hansson 等人的改良方法。

然而最根本的原因在于酶法分析成本较高,因此选用的人并不太多,更多的人还是乐意选用溶剂分析法。

本文作者综合考虑各种方法的优缺点之后,最后选择了Selvendran R R 的冷中性洗涤剂纤维提取法。

从实用的角度考虑,对Selvendran 法作了改良。

212　改良的CNDF 法对细胞壁物质提取的纯净性
在细胞壁物质提取过程中,SL S 和PAW 溶液处理的目的在于溶解细胞间蛋白质,用φ=90%的DMSO 溶剂是为了溶解淀粉类物质。

此外,这三种溶剂在溶解蛋白质、淀粉过程中,少量的脂肪类物质也伴随溶出。

糖化酶和蛋白酶处理的目的在于进一步分解不溶于SL S 2PAW 2DMSO 的残渣中可能残留的少量细胞间蛋白质和淀粉成分。

从表1的分析结果可知,两种原料经上述处理后,成分发生了很大的变化,分别占豆渣、豆皮总量的w =15.8%、1318%(湿基,下同)的蛋白质和w =8.3%、2.3%的脂肪已基本除尽。

豆渣、豆皮CWM 中少量的蛋白成分可能是细胞壁结合态蛋白质,因为经SL S 2PAW 和蛋白酶处理后细胞间的蛋白质已去除干净。

CWM 物料不与I 22KI 发生呈色反应,说明其不含淀粉类物质。

从图2的显微镜照片可直观看出,豆渣、豆皮中含有相当数量的蛋白质和脂肪球,而经提取出的豆渣与豆皮细胞壁物质则未发现它们的存在。

综合化学分析结果与显微照片直观观察表明,用改良的CNDF 法提取出的细胞壁物质(膳食纤维)很纯净,不带污染成分。

57　第12期 郑建仙等:膳食纤维分析方法的研究
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表1　SL S2PAW2DMSO处理前后SR与SB化学成分的变化(%)3
Table1　The chemistry composition of SR、SB material before and after SL S2PAW2DMSO treatment 样品水分蛋白质脂肪粗纤维非粗纤维碳水化合物木质素灰分
SR　13.2　15.8　8.3 17.3 39.5 2.1　3.8 SR2CWM13.5 2.6 /22.454.5 2.7 4.3
SB12.813.5 2.326.238.8 2.2 4.2 SB-CWM13.5 2.8 /31.644.6 2.9 4.6
3非粗纤维碳水化合物数据是100
与其它成分含量的差值。

(A) (B) Array
(C) (D)
图2　透射电镜显微图
Fig.2　Transmission electron micrographs of the internal structure
A:SR　B:SR2CWM　C:SB　D:SB2CWM
213　改良的CNDF法对细胞壁物质提取的完整性
细胞壁物质提取过程的物料衡算见表2。

SL S、PAW和DMSO溶解液透析后的冷冻干燥产物,分别用糖化酶与蛋白酶处理,以分解所含的蛋白质与淀粉,酶处理前后物料重量的变化情况列于表3中。

从两表可知,在提取SR2CWM过程中,被w=1%的SL S溶解的CWM占原料总量的w=0.66%,被PAW溶解的占w=0.33%,被φ=90%的DMSO溶解的占w= 1.24%;如换算成相对于SR中细胞壁物质总量(干基)的质量分数,此三个数据分别是w= 1105%、0152%和1192%。

相对于SB来说,由w=1%SL S、PAW和φ=90%DMSO溶解而损失的CWM相对于SB物料总量的质量分数为w=1154%、0149%和1155%,换算成相对于SB2CWM总量(干基)的质量分数则是w=2116%、0168%和2117%。

观察表3中φ=90%DMSO 这行数据,酶处理前后物料重量变化不大,也就是说被φ=90%DMSO 溶解的几乎都是细胞壁成分。

因φ=90%DMSO 是淀粉的良好溶剂,这说明在SR 与SB 原料中淀粉含量几乎为零。

在图2的显微照片上也未发现SR 与SB 中有淀粉颗粒的存在。

既然SR 与SB 几乎不含淀粉,则用φ=90%DMSO 溶剂处理这一步就可省去。

当然,对于那些富含淀粉的原料(如麦夫皮),DMSO 处理显然是非常重要的。

　表2　从10g 豆渣与豆皮中提取
细胞壁物质的物料衡算(mg )
Table 2　Material mass balance of cell
wall material fractionated from 10g
soybean residue or bran 原料水分
SLS PAW DMSO CWM (干)SR
132014727793626067SB 12801082
5213456772表3　SL S 2PAW 2DMSO 溶解物的物料重量变化(mg )Table 3　Mass weight change of SL S 2PAW 2DMSO solute 试验组别SLS PAW DMSO SR 酶解前1472　779312酶解后　6633124SB 酶解前1082　521345酶解后　15449155 被SL S 、PAW 和DMSO 三种溶剂所溶解的细胞壁成分主要是一些冷水溶性果胶类物质、木聚糖和阿拉伯木聚糖等[5]。

对于SR 来说,在大豆浸泡、磨浆及分离过程中冷水溶性果胶类物质大多已流失,故溶解在上述三种溶剂中的CWM 成分较少(总量占CWM 的w =3.45%)。

对于SB 来说,其所含的冷水溶性物质较多,故在提取过程中的损失要大一些,总量达w =5.01%。

Selvendran R R 等人曾用CNDF 法分析过土豆、卷心菜、苹果和小麦麦夫皮等原料中的CWM 含量。

结果表明,由三种溶剂引起的CWM 总损失率在2%10%之间。

由此可见,经改良的CNDF 法与Selvendran R R 原推荐法对细胞壁物质提取的损失率相同。

214　改良CNDF 法与原推荐法的比较
根据Selvendran R R 等人推荐的原方法,在w =1%SL S 浸提过程中需用湿球磨来进一步破碎原料颗粒,且在DMSO 提取前需用超声波处理30min 。

据研究,分散在w =1%SL S 的物料经球磨后,紧密的物料逐渐松散开,这样溶剂就易于浸入,超声波处理的目的与此类似。

为了简化分析方法,作者省去了湿球磨与超声波处理过程,而改以延长溶剂的处理时间来代替。

原法推荐的SL S 、PAW 和DMSO 三种溶剂作用时间分别为15h 、30min 和16h ,分别将其延长至22h 、40min 和22h 。

上述的分析结果表明,这三个参数是完全可行的。

用改良CNDF 法能提取出十分纯净的细胞壁物质,且提取得率与原方法相一致。

这就是说,改良的CNDF 法对细胞壁物质的提取效果与原方法完全相同。

但由于改良法省去了湿球磨与超声波处理阶段,因此更显得方便与实用。

由改良法分析得知,豆渣中的膳食纤维(CWM 与灰分的差值)干基含量为w =68.8%,豆皮中的膳食纤维干基含量为w =77.1%(均包括从SL S 2PAW 2DMSO 溶剂中回收的CWM 数量)。

3　结论
出于简化的目的,我们对Selvendran R R 等人推荐的CNDF 法作了改良。

改变了各种溶剂的提取时间,省去了原法的湿球磨与超声波处理阶段,将原法中SL S 2PAW 2DMSO 提取时间15h 、30min 与16h 分别延长至22h 、40min 与22h 。

化学成分分析与电镜观察表明这种改良法是切实可行的,相比于原方法显得更实用与方便。

77　第12期 郑建仙等:膳食纤维分析方法的研究
87华南理工大学学报 第24卷　
参　考　文　献
1　郑建仙1功能性食品1北京:中国轻工业出版社,199518
2　Southgate D A T.Determination of carbohydrates in foods.Ⅱ.Unavailable carbohydrates.J Sci Food Agric,1969,20:331 3　Van Soest P J.Collaborative study of acid2detergent fibre and lignin.J Ass Off Anal Chem,1973,56:781
4　Selvendran R R,Ring S G,DuPont M S.Assessment of procedures used for analysing dietary fibre and some recent develop2 ments.Chem lnd,1979,7:225
5　Selvendran R R,Stevens B J H.Simplified methods for the preparation and analysis of dietary fibre.J Sci Food Agric,1980, 31:1173
6　Hellendoorn E W,Noordhoff M G,Slagman J.Enzymatic determination of the indigestible residue(dietary fibre)content of human food.J Sci Food Agric,1975,26:1461
STUDIES ON THE ANAL YSIS M ETHOD OF DIETAR Y FIBRE
Zheng Jianxian　S un Youf ang
(Institute of Light and Chemical Industry,South China Univ.of Tech.)
Abstract　The extraction method of cold neutral detergent fibre(CNDF)suggested by R R Sel2 vendran is improved.Chemical and microscopic analyses show that the fibre extraction effect of the improved method is the same with the original.The improved method is more convenient and practical because of omitting wet ball2milling and ultrasonic treatment.
K ey w ords　cold neutral detergent fibre;dietary fibre;wet ball2milling;ultrasonic treatment。