高效液相色谱法测定糕点和果汁中纳他霉素的方法学验证

高效液相色谱法测定糕点和果汁中纳他霉素的方法学验证
作者：卢薇周美丽
来源：《食品安全导刊》2024年第03期
摘要：为了验证宝鸡市食品药品检验检测中心是否有能力开展纳他霉素新方法《食品安
全国家标准食品中纳他霉素的测定》（GB 5009.286—2022）的检测项目。

本文使用高效液相色谱仪，对糕点和果汁中纳他霉素进行分析，外标法定量，验证了本方法的线性关系、方法检出限、精密度和回收率。

结果表明，纳他霉素在0.5～10.0 μg·mL-1呈现良好的线性关系，方
法检出限、精密度和回收率均能达到标准方法要求。

因此，本实验室具备检测纳他霉素的能力。

关键词：纳他霉素；外标法；高效液相色谱仪；方法学验证
Methodological Validation of High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Natamycin in Pastries and Fruit Juice
LU Wei， ZHOU Meili
（Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center， Baoji 721000， China）
Abstract： In order to verify whether the Baoji Food and Drug Inspection and Testing Center has the ability to carry out the testing project of the new method GB 5009.286—2022 for natamycin. This article uses a high-performance liquid chromatography to analyze natamycin in pastries and fruit juice. The external standard method is used for quantification to verify the linear relationship， detection limit， precision， and recovery rate of this method. The results showed that natamycin exhibited a good linear relationship within the range from 0.5 μg·mL-1 to10 μg·mL-1， and the detection limit，precision， and recovery rate of the method can meet the requirements of the standard method. Therefore， our laboratory has the ability to detect natamycin.
Keywords： natamycin; external standard method; high-performance liquid chromatography; methodology validation
納他霉素，又名匹马霉素，是一种外观呈近白色或奶油黄色，无臭无味的结晶粉末，它是天然的多烯大环内酯类物质，对大部分的霉菌和酵母菌都具有极强的抑制作用[1]。

研究表明，纳他霉素在水和油脂中的溶解度极低，人体摄入少量不会造成有害影响[2]。

近些年通常将其应用于食品保鲜领域，作为防腐剂在焙烤食品和水果表面使用，延长其保质期，或者与山梨酸钾进行复配使用，既可以节约成本，又效果显著[3-4]。

在《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中规定其残留量应小于10 mg·kg-1。

但不良商家为降低成本，延长货期而违规使用，因此加强对纳他霉素的监管十分必要。

目前在食品检测国家标准中，以高效液相色谱法为主要检测手段。

新方法《食品安全国家标准食品中纳他霉素的测定》（GB 5009.286—2022）于2022年12月30日实施，此方法中规定了食品中纳他霉素的处理方法。

本文在此基础上对糕点和果汁类方法的线性范围、基质效应、方法检出限、精密度和回收率进行验证，并对其在本实验室的有效性进行评价。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇（色谱纯），DIKMA；冰乙酸，成都市科龙化工试剂厂；实验用一级水；纳他霉素有证标准物质（C33H47NO13，CAS号：7681-93-8），纯度≥98%，TM Standard。

1.2 仪器与设备
Ultimate3000高效液相色谱仪（配紫外检测器），Thermo Fisher Scientific；SQP Practum224-1CN电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；KQ-500DE超声波提取器，昆山市超声仪器有限公司；TG16-WS离心机，湖南沪康离心机有限公司；VG3涡旋混匀器，IKA。

1.3 色谱条件
色谱柱：InertSustain C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温：30 ℃；检测波长：305 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；流动相A：甲醇；流动相B：乙酸+水=5+95（体积比）。

梯度洗脱程序见表1。

1.4 实验方法
1.4.1 糕点类处理方法
称取混匀的样品约5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入15.0 mL甲醇超声提取20 min，加入5.0 mL水混匀，以4 000 r·min-1离心10 min，上清液经有机滤膜过滤待用。

1.4.2 果汁类处理方法
称取混匀的样品约5.0 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入15.0 mL甲醇超声提取20 min，以4 000 r·min-1离心10 min，将上清液转移至25 mL容量瓶，用水定容至刻度混匀，经有机滤膜过滤待用。

1.4.3 标准曲线的绘制
准确称量25 mg（精确至0.1 mg）纳他霉素标准物质，加入1 mL冰乙酸及适量甲醇超声溶解，用甲醇定容至100 mL。

准确吸取10.0 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度混匀配制成标准中间液。

再分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL标准中间液于5个10 mL容量瓶中，用初始流动相定容，现用现配。

2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
本实验中，纳他霉素在冰乙酸存在的酸性条件下，在甲醇中溶解度较高。

因此选择初始流动相作为定容试剂，得到的纳他霉素的峰型较好。

选用甲醇：（乙酸+水=5+95）=55∶45的流动相比例，使纳他霉素的出峰时间保持在10 min左右，可以避免杂质峰干扰。

2.2 线性关系考察
按上述色谱条件，以标准系列工作液中纳他霉素的浓度为横坐标，得到的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，纳他霉素在0.5～10.0 μg·mL-1呈现良好的线性关系，线性回归方程为
y=0.887 8x+0.000 05，相关系数r为0.999 8。

2.3 方法检出限考察
称取11份阴性样品，按照标准规定的方法检出限浓度，加入阴性样品中，按1.4的方法处理，进样测试。

根据《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》（GB/T 32465—2015）[5]中7.5.4的要求，11次重复性测试的偏差均在方法检出限（±20%）范围内，认为实验方法检出限满足相关要求，详见表2、表3。

2.4 精密度考察
称取阴性样品21份，分为3组，分别加入不同浓度的标准溶液，制成高中低3种浓度的样品，按上述条件进行测定，每个水平重复检测7次，计算其RSD值及实验室内变异系数CV，以反映测定结果之间的精密度，结果见表4、表5，根据《合格评定化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中5.6.1及附录B中的要求，精密度符合验证要求。

2.5 加标回收考察
称取阴性样品9份，分成3组，分别加入检出限、定量限、10倍检出限 3种浓度的标准溶液，按上述色谱条件，进行测定。

测出3种水平加样回收率平均值，结果见表6、表7，根据《合格评定化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）[6]中5.5.2及附录A中的要求，回收率符合验证要求。

2.6 實际样品测定
为进一步验证本方法的有效性，选取宝鸡市市售的糕点和果汁进行检测，结果均为未检出，并且线性和回收率与本验证结果一致，后续将继续抽检更多的样品，为宝鸡地区纳他霉素的监管提供有力的数据支持。

3 结论
在本实验室现有的仪器设备和实验条件下，以《食品安全国家标准食品中纳他霉素的测定》
（GB 5009.286—2022）为基础，研究了糕点和果汁类纳他霉素的检测方法。

经验证，该方法对糕点和果汁类检测呈现良好的线性范围，方法准确性和重复性好，本实验室能力满足新方法要求。

参考文献
[1]陈方圆，戴久竣，徐家延，等.纳他霉素抑菌机制及在食品保鲜中的应用研究进展[J].食品科技，2021，46（9）：48-49.
[2]孙成行，张福娟，王廷平.纳他霉素的应用与检测方法研究进展[J].中国食品添加剂，2017，5（3）：178-182．
[3]张祖丽，徐欢，李歆，等.纳他霉素在蛋糕表面防腐保鲜中的应用研究[J].食品与发酵工业，2023，49（16）：182-187.
[4]关欣，郭迎迎，张雨桐，等.纳他霉素在食品检测中的研究新进展[J].吉林农业，2019（21）：75.
[5]国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.化学分析方法验证确认和内部质量控制要求：
GB/T 32465—2015[S].北京：中国标准出版社，2015.
[6]国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.合格评定化学分析方法确认和验证指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.
作者简介：卢薇（1989—），女，陕西宝鸡人，硕士，助理工程师。

研究方向：食品检验。