GFP-FABD2和GFP-MBD标记蛋白对拟南芥悬浮细胞培养及应激响应能力的影响

GFP-FABD2和GFP-MBD标记蛋白对拟南芥悬浮细胞培养
及应激响应能力的影响
时兰春;王伯初;杨兴艳;张运刚;王益川
【摘要】以转GFP-FABD2和GFP-MBD基因的拟南芥为材料,研究了GFP-FABD2和GFP-MBD这两种细胞骨架标记蛋白对拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及应激响应能力的影响.结果表明:(1)GFP-MBD标记蛋白延长愈伤的出愈时间,改变愈伤形态,使转基因拟南芥种子的出愈量减少为野生型的59％、悬浮细胞的长短轴比缩小为1.20±0.21、第7天细胞活力下降为0.66±0.09,影响细胞的生长曲线.(2)GFP-FABD标记蛋白虽对愈伤生长影响不大,但却使悬浮细胞的长短轴比显著增加为2.49±1,18、第7天细胞的活力下降为0.87±0.06,造成悬浮细胞生长曲线的改变.(3)通过调整培养条件的激素水平,以上两种细胞骨架标记蛋白对悬浮细胞生长的影响可以得到修复.(4)检测优化条件下培养的GFP-FABD2或GFP-MBD悬浮细胞对温度、渗透压、机械应力等环境改变的应激响应能力,结果未发现与野生型有明显区别.%The effects of the plant cytoskeleton labels,GFP-FABD2 and GFP-MBD were investigated on Arabidopsis callus induction, suspension cells cultivation and capacity of response to stress. The results showed that the expression of these two fusion proteins diversely effected the callus induction and suspension cell growth. (l)GFP-MBD expression extended the time of callus induction,altered the callus morphology, reduced the quantity of callus to 59% of wild type,decreased the major/minor axial ratio of suspension cells to 1. 20±0. 21,reduced the relative viability of 7-day-old suspension cultures to 0. 66±0. 09 an d altered cell growth curve.
(2)GFP-FABD2 expression had no apparent effects on callus,but it
significantly increased the major/minor axial ratio of suspension cells to 2. 49±1. 18,reduced the relative viability of 7-day-old suspension cultures to 0. 87 ± 0. 06 and effected cell growth curve. (3)These effects can be restored by adjusting the hormone level. (4)In the optimized condition, we did not score any significant deviation in temperature,osmotic pressure,mechanical stress and other stress from those found in wild type Arabidopsis suspension cells.
【期刊名称】《西北植物学报》
【年(卷),期】2012(032)005
【总页数】9页(P931-939)
【关键词】GFP-FABD2;GFP-MBD;拟南芥;悬浮细胞;应激响应
【作者】时兰春;王伯初;杨兴艳;张运刚;王益川
【作者单位】重庆大学生物工程学院,重庆400044;白求恩军医学院,石家庄050081;重庆大学生物工程学院,重庆400044;重庆大学生物工程学院,重庆400044;重庆大学生物工程学院,重庆400044;重庆大学生物工程学院,重庆400044
【正文语种】中文
【中图分类】Q789
细胞骨架（cytoskeleton，CSK）是位于细胞膜内侧的蛋白质纤维网架系统，与细胞形态建成、细胞运动、物质运输、能量转换、细胞分化等多种生命活动密切相关［1］.细胞骨架是高度动态结构，其排布与功能有着密切关系.因此细胞骨架的观
察方法在细胞骨架研究中具有关键性作用.目前，GFP蛋白标记具有分子量小、无
生物毒性、灵敏度高等诸多优点而非常适合于活体细胞的骨架动态研究，因而通过GFP蛋白标记细胞骨架已成为主要趋势［2］.
GFP－FABD2（green fluorescent protein－the second actin－binding domain of Arabidopsis fimbrin 1）是一种微丝骨架的荧光标记蛋白，它是由GFP基因与拟南芥丝束蛋白1（Fimbrin1）的第二肌动蛋白结合结构域的基因相
融合构建而成［3］.利用GFP－FABD2融合蛋白，Sano等［4］实时观察了BY
－2（Nicotiana tabacumL.cv.Bright Yellow 2cell line）细胞在整个细胞周期中
微丝骨架的动态，Staiger等［5］发现拟南芥皮层微丝骨架的动态是由快速生长
和其他相关蛋白所介导的剪切活性主导.GFP－MBD（green fluorescent protein －the microtubule binding domain of microtubule associated protein 4）是一种微管骨架的荧光标记蛋白，它是由GFP基因和源自哺乳动物的微管结合蛋白
4（MAP4）的微管结合结构域的基因融合构建而成［6］.借助GFP－MBD融合
蛋白，Bruaene等［7］对拟南芥根毛发育过程中微管的动态排布进行了研究，Hamant等［8］发现了植物发育过程中组织机械应力对微管排布的指导作用.目前，这两种融合蛋白已在拟南芥细胞微丝和微管骨架的动态观察中得到广泛应用［9］.有一些文献报道了这两种外源性蛋白表达对拟南芥植株生理和形态影响的研究结果，如Sheahan等［3］报道GFPFABD2没有对拟南芥的形态和发育造成影响，Voigt等［10］认为GFP－FABD2融合蛋白不会干扰拟南芥植株对光、黑暗和重力的生长响应；Granger等［11］观察到GFP－MBD转基因型拟南芥除了根以外，其叶片的尺寸、数量、分支、长角果的数量，平均高度等都与野生型差别不大.但这两种融合蛋白对悬浮细胞形态及应激响应的研究却鲜有报道，仅Granger等［12］在GFP－MBD转基因BY－2细胞的微管骨架研究中，观察到GFP－MBD 细胞不仅长短轴比略小于野生型，并且其S型的生长曲线也与野生型不完全相同.
悬浮细胞是植物细胞生长的微生物化，具有形状和细胞团大小大致相同，生长迅速，重复性强，培养条件容易控制等优点［13］，以转基因悬浮细胞为原料研究细胞
骨架在应激响应中的动态变化，便于对细胞所受环境刺激进行调控和量化分析，有助于深入了解植物细胞骨架在应激感受和响应中的作用机制.一个良好悬浮细胞系
的建立不仅受到愈伤质量、继代周期、激素水平、转速、光照水平等因素的影响，也与基因型有密切的关系［13］.而GFP－FABD2和GFP－MBD转基因型悬浮细胞的生理状态和应激响应能力是对细胞骨架在应激响应中作用分析的统计学意义的重要影响因素，因此，本实验通过激素调整建立状态相对良好的转基因悬浮细胞系，并考察其对温度、渗透压、外源性机械刺激的响应情况.
1.1 悬浮细胞系的建立
本课题中所使用的GFP－FABD2拟南芥种子由德国波恩大学的Voigt教授无偿提供，GFPMBD拟南芥种子由美国加利福尼亚技术研究院的Meyerowitz无偿赞助. 取适量拟南芥种子先用75%乙醇浸泡1min，弃去乙醇.再用10%次氯酸钠浸泡
10min，弃去次氯酸钠.最后再以无菌水反复冲洗3次［14］.无菌条件下将处理后的种子接种于灭菌后的MS固体培养基（含有20g／L蔗糖、7g／L琼脂、
100mg／L肌醇、150mg／L谷氨酰胺、2.0mg／L 2，4－D和0.05mg／L KT，pH 5.8）上.将接种好的培养瓶放于恒温光照培养箱中培养，温度23℃，16h日光照，相对湿度70%～80%.4周后，将生长出的愈伤取适量继代.继代培养的培养基和培养条件与诱导培养相同.出愈量的计算方法如下：
出愈量＝愈伤鲜重／接种的种子重量
愈伤组织继代培养4周后，用镊子轻轻夹碎，在无菌条件下称重，将1g左右的愈伤接入50mL液体MS培养基（含100mg／L肌醇、150mg／L谷氨酰胺、30g
／L蔗糖、2mg／L 2，4－D、0.05mg／L KT，pH 5.8）中.将装有培养基的三角瓶置于恒温振荡培养箱内，于120r／min、23℃条件下黑暗培养.每隔7d，以新
鲜MS液体培养基继代一次.继代时，将10 mL起始悬浮细胞培养液添加到40mL 新鲜MS培养基中［14］.
1.2 悬浮细胞培养系的优化
为得到状态更好的转基因悬浮细胞系，在参考文献［14～16］的基础上，采用
MS＋100mg／L肌醇＋150mg／L谷氨酰胺＋30g／L蔗糖为基础培养基，以2，4－D、NAA和KT激素为3种因素，设计正交实验如表1.继代后第7天细胞的相对活性作为比较基准.
1.3 悬浮细胞生长状态的评估
1.3.1 细胞鲜重的测定方法［17］将悬浮细胞培养液充分振荡均匀，吸取1mL悬浮细胞液注入预先称重的1.5mL eppendorf管，12 000r／min高速离心10min，真空吸去上清液后，室温下敞口自然风干24h，称重，减去已知的空管重量即为
1mL悬浮细胞液中细胞的鲜重，重复3次.
1.3.2 细胞形态的检测将继代7d后的悬浮细胞培养液充分振荡均匀，吸取20μL
悬浮细胞液滴于载玻片上，轻轻压上盖玻片.将样品置于配备有CCD的显微镜（Leica DMI 4000B）载物台上，使用40倍镜头，任意选取多个视野进行拍
摄.Image prove plus（IPP）软件分析所摄细胞的长短轴比率.
1.3.3 悬浮细胞活力的测定采用氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrezolium chloride，TTC，Amresco－0765）法检测悬浮细胞活性.基本步骤参照Towill等［18］所述略有修改.
取1mL悬浮细胞培养液和1mL 0.4%TTC溶液（0.05mol／L，pH 7.5磷酸缓冲
液配制），充分混匀后于室温下避光反应6h.真空吸去TTC溶液，去离子水洗涤1遍.加入3mL的95%乙醇（95%乙醇缓冲液，pH 7.4，加0.05%（V／V）吐温80，充分混匀），置于振荡机上轻柔振荡提取9h.取乙醇提取液，在分光光度计上485nm处测定其分光光度值.按比例稀释乙醇提取液，使其OD值维持在1.0以下，
空白提取液调零，重复3次.与此同时，按上述方法测定单位体积细胞鲜重.按下式估算细胞活性：
悬浮细胞活性＝实际OD值×稀释倍数／细胞鲜重（g）
继代后悬浮细胞相对活性用下式估算（起始细胞活性测定方法同上）：
悬浮细胞相对活性＝被测悬浮细胞活性／起始悬浮细胞活性
1.4 细胞骨架的观察
分别吸取继代后1～7dGFP－FABD2或GFPMBD悬浮细胞100μL滴于共聚焦玻皿中，置于LEICA TCS SP5共聚焦显微镜（Leica，Wetzlar，Germany）下，观察细胞内微丝或微管骨架的荧光状态.
1.5 悬浮细胞应激能力的检测
1.5.1 悬浮细胞对外源性机械应力响应能力检测
根据预实验结果，将继代3d后的悬浮细胞置于180r／min摇床中加速振荡
30min后，测量细胞产生H2O2的情况.
Amplex Red（Molecular Probes，A12222）法［19］分析H2O2含量.即将Amplex Red和辣根过氧化酶（Sigma P6782）在加速振荡前加入悬浮细胞培养基中，辣根过氧化酶和Amplex Red的终浓度分别为1U／mL和100μmol／L.加速振荡结束后，使用荧光光度计（PERKIN ELMER LS50B）测量培养基中的荧光值，荧光分光光度计的最大激发波长设为560nm，发射波长设为590nm.溶液中H2O2的含量根据标准曲线折算.悬浮细胞液中细胞的鲜重按照1.4所述测量. Amplex Red储藏液：分析纯DMSO配制，储存于－20℃.
使用商用H2O2制定0～2μmol／L范围内的标准曲线，方法同上.
悬浮细胞产生H2O2的量如下计算：
H2O2（μmol／gFW）＝［（F／391.52）×d］／m
式中，F是荧光光度计上读出的荧光值，d是稀释因子，m是每mL溶液中细胞的
平均湿重.
1.5.2 悬浮细胞对高渗的应激响应能力检测离心收集继代3d后的悬浮细胞（1 000r／min，5 min），调整悬浮细胞密度大致在1×105个／mL.将悬浮细胞与30℃～40℃的2%（W／V）低熔点琼脂（Sigma A6560）按照1∶1混匀.为了防止低熔点琼脂对细胞造成渗透冲击，使用含有30g／L蔗糖的MS溶液配制琼脂.
将60μL琼脂与细胞的混合物迅速涂布于35mm的细胞培养皿底部形成均匀的琼
脂薄层，然后将培养皿盖好保湿.将样品置于配有CCD的倒置显微镜（Leica DMI 4000B）下夹好固定，找到细胞后（镜头为40×），显微镜开始录像，随即打开
培养皿盖轻轻滴入100μL 1mol／L甘露醇的高渗溶液，此后连续录像计时5min.滴加药品时动作轻微，防止样品移动.
悬浮细胞对高渗应激响应的能力通过单位时间内的质壁分离率评估，具体如下：利用实时录像，分别计数1min内和1～5min内出现质壁分离现象的细胞个数，然
后除以总细胞数，得到1min内和1～5min内的悬浮细胞质壁分离率.
1.5.3 悬浮细胞的冷耐受实验将继代培养3d后的悬浮细胞转入4℃振荡培养箱中，120r／min，避光培养12h.然后重新放回23℃振荡培养箱中继续培养3d，随即
按1.5所述测量细胞的相对活性.
1.6 统计分析
利用SPSS 19软件进行统计分析，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著
性差异.
2.1 愈伤组织的诱导
连续观察多批次（n＝5）的3种基因型拟南芥愈伤的生长情况，发现3种基因型
之间在出愈时间、出愈量以及愈伤形态等方面都存在一定的差异（图版Ⅰ）.从出
愈时间来看，GFP－MBD的出愈时间明显晚于GFP－FABD2型和野生型（图版Ⅰ，a～c），后两者在第3天即可观察到子叶和毛状物，而GFPMBD在第5天才
能观察到少量子叶（图版Ⅰ，a）.从愈伤形态来看，GFP－MBD的愈伤从第14天起出现明显颗粒状愈伤（图版Ⅰ，d），而GFP－FABD2和野生型则是先生成不定芽（图版Ⅰ，e、f），在第20天时才出现较多的愈伤（图版Ⅰ，g～i）.从出愈量看，GFP－MBD的出愈率明显低于GFP－FABD2和野生型，后两者则没有明显区别（图1）.4周后，取重量相当的3种基因型愈伤继代培养.继代培养过程中未发现三者的显著差异，4周后均能形成浅黄色质地疏松的愈伤.
2.2 悬浮细胞培养体系的建立
当3种基因型采用同样的激素水平（2，4－D 2.0 mg／L，KT 0.05mg／L）的MS培养基培养时，3种基因型在形态和活力上都有一定差异.在形态方面，野生型细胞大多呈椭圆形，其长短轴比为1.46，SD为0.40；FABD2型细胞明显比野生型偏长，其细胞长短轴比为2.49，SD为1.18；MBD型细胞则较为短圆，其细胞长短轴比为1.20，SD为0.21.统计分析表明三者之间差异显著，而FABD2型与其他两者之间为极显著性差异（表2）.测定继代第7天细胞的相对活性，可以看出三者之间也有显著性差异，其中野生型的相对活性最高，FABD2次之，MBD 的活性明显低于前二者（表2）.为了了解不同基因型悬浮细胞在一个继代周期内的生长情况，测定了3种悬浮细胞生长量的变化曲线，从图2可以看出，3种悬浮细胞虽都表现出S型曲线，但生长曲线之间还是有较为明显的区别，其中在第2天时，FABD2和MBD就与野生型之间有差异.第3天时，FABD2的生物量有明显的提升，而MBD的增长趋势则明显见缓。

此后，FABD2型与野生型保持较小的差距，但MBD的生长一直处于落后状态（重复3次）。

2.3 悬浮细胞培养体系的优化
通过正交实验确定FABD2型拟南芥悬浮细胞的最适培养基的激素水平为2，4－D 2.0mg／L，NAA 0.05mg／L，KT 0.05mg／L；MBD悬浮细胞的最适培养基的激素水平为2，4－D 2.0mg／L，NAA 0.5mg／L，KT 0.5mg／L。

在最适激素
水平条件下，FABD2和MBD的活性有了明显提高，与野生型相比，虽然均值还
有一些距离，但统计分析表明已无显著差异（表2）。

利用共聚焦显微镜观察转基因悬浮细胞的细胞骨架，结果显示，GFP－MBD细胞中的微管骨架、GFP－FABD2细胞中的微丝骨架均可清晰观测到（图版Ⅰ，j、k）。

调整激素水平也会
影响细胞的形态，在最适激素水平条件，FABD2细胞的长短轴比为1.99，SD＝0.99，MBD细胞的长短轴比为1.38，SD＝0.32。

二者与野生型的细胞形态差异
明显减少（表2）。

另外，分别测定了最适激素条件下3种细胞的生长曲线，可以看出在第2天时，FABD2和MBD与野生型还存在明显差距，但第3天以后，FABD2型细胞与野生型的生长趋势非常接近，MBD型细胞虽然在第3天时与前
两者还有较大差别，但第4天时出现了明显改善（图3）。

2.4 悬浮细胞对环境刺激的应激响应能力
H2O2的浓度在0～2μmol／L范围内与其荧光值成正比（图4）。

经Excel处理，可得到H2O2浓度的标准曲线的趋势线公式为y＝391.52x（x为H2O2的浓度，y为对应的荧光值）。

由此，通过测量，可以看出当振荡速度突然加快后，3种悬浮细胞的H2O2产生量都明显增加，但没有显著差异（图5）。

向包埋细胞滴加1mol／L甘露醇，统计结果显示野生型、FABD2、MBD等3种
悬浮细胞在1min内、5min内的质壁分离率没有显著性差异（图6）。

在冷耐受
实验中，3种细胞活性都有一定程度下降，但下降的幅度并不显著（图7）。

模式植物拟南芥悬浮细胞系的建立是一个相对比较成熟的技术［14，20］，在此
基础上成功培养了野生型col－0拟南芥的悬浮细胞.然而在FABD2和MBD转基
因细胞的培养实际中，可以明显地看到野生型细胞培养的最适激素条件并不适合这两者，它们的活性明显低于野生型，形态也与野生型有较大的差别.影响悬浮细胞
质量的因素有很多［13］，但在培养条件和方法等方面完全一致时，对其造成干
扰的主要是愈伤组织的质量和基因型.虽然MBD转基因拟南芥的出愈率和出愈时
间与野生型和FABD2型有比较明显的差距，但其继代后愈伤的形态与后二者区别不大，均为淡黄色疏松的愈伤组织，镜检下也未见明显区别.因此在接种量一致的情况下，可能是转基因造成了悬浮细胞的差异.
GFP－FABD2是由GFP基因与拟南芥Fimbrin1的第二肌动蛋白的结合结构域的基因相融合构建而成［3］.Sheahan等［3］认为GFP－FABD2能够清晰指示拟南芥植株各种细胞内的微丝网络结构和动态变化，并不会对植物形态造成任何负面影响.Voigt［10］也认为GFP－FABD2融合蛋白是迄今为止最适合观察植物微丝骨架的报告蛋白.然而，这并不意味着该融合蛋白对拟南芥没有任何影响.Voigt ［10］曾观察到GFP－FABD2幼苗根的生长速度稍稍超过野生型的植株.本研究在培养GFPFABD2悬浮细胞的过程中，则观察到了该转基因悬浮细胞在形态和活力方面与野生型细胞的差距，特别是在形态上，GFP－FABD2细胞明显偏长而且变化比较大.Fimbrin1属于Fimbrn／Platin类肌动蛋白结合蛋白，体外生化分析表明，原核表达的拟南芥Fimbrin 1可以结合并交联花粉的微丝骨架，表现出稳定微丝的特性［21］.因此，当融合蛋白GFPFABD2在拟南芥细胞中表达，并结合于微丝骨架时，很有可能体现出Fimbrin1促进微丝成束的部分功能，对微丝的网络图式产生一定影响.众所周知，微丝骨架的排布在植物细胞的生长中具有重要功能［22］，当其发生改变时，细胞的形态及活力必然也会受到干扰.比如Dong 等［23］发现，当肌动蛋白解聚因子（ADFs）过量表达时，会破坏细胞质的F－肌动蛋白束，细胞弥漫性生长和根毛扩张减缓.反义抑制ADF增加细胞质F－肌动蛋白密度，弥漫性生长细胞和根毛则过度扩张.相对于植物植株来讲，悬浮细胞的生长发育对内外因素的变动更为敏感，这很可能是造成GFP－FABD2形态和活力差异的主要原因.同样，对于GFP－MBD转基因悬浮细胞来说，融合蛋白GFP－MBD也很可能影响了微管骨架的排布，进而干扰细胞的形态和活力［6，12］.微管结合蛋白4（MAP4）属于结构性微管相关蛋白（microtubule associated
proteins MAPs），它在细胞内表达非常广泛，起到了稳定和聚合间期及有丝分裂期细胞的微管的作用［24］.Marc等［6］利用GFP－MBD融合蛋白清晰地观察
到了豌豆的叶片组织细胞内的微管网络，证实该网络排布模式与以往用其他技术所报道的微管排布没有区别，但又指出当该融合蛋白高水平表达时可能会对微管的功能造成影响，产生异常表型［6］.这可能就是造成GFP－MBD拟南芥在组织培养过程中，其愈伤组织的诱导、悬浮细胞的形态和活力与野生型有显著差异的一个重要原因.
需要关注的是，激素在植物细胞的生长发育中也具有重要作用，不同的激素在植物细胞生长和分裂中的作用不同，比如2，4－D对细胞的分裂有促进作用，NAA则对细胞的伸长和分裂都具有促进作用［25］.植物组织培养中常通过调整植物激素
的组成和比例来进行改良.在研究中通过调整悬浮细胞培养的激素水平，有效改善
了GFP－FABD2和GFPMBD拟南芥悬浮细胞的形态、活力和生长曲线，说明细
胞骨架对植物细胞生长所造成的影响可以通过激素的作用得到一定程度的抵消.
近些年来，不断有报道指出细胞骨架在环境应激响应中具有重要作用［8，26－28］，那么当细胞骨架被融合蛋白标记后是否会影响细胞的应激响应能力？本研
究检验了培养条件优化后的继代3d的GFPMBD、GFP－FABD2两种转基因悬浮细胞与野生型细胞在渗透压、温度和机械应力等几种环境刺激下的应激响应能力，该时期的细胞处于对数生长期前期，对环境变化比较敏感，但实验结果没有发现三者之间有显著性的区别.为何标记细胞骨架的GFPFABD2或GFP－MBD融合蛋白没有影响细胞的应激响应能力？关键原因在于这两种融合蛋白的表达并不影响细胞骨架的动态变化［6，10］.以GFP－MBD为例，Marc等［6］观测了该融合蛋
白标记后微管的伸长和收缩的速度，结果与未标记微管的体外装配实验得到的数据没有差距，因此提出该融合蛋白不影响微管骨架的动态.借助GFP－MBD融合蛋白，Bruaene等［7］考察了拟南芥根毛发育过程中微管的动态和重组，提出微管的线
性排列基于微管动态生长的反复重新定向.Vos等［29］观察了BY－2细胞在细胞间期和早前期带（PPB）形成过程中微管的动态变化，发现微管在早前期带形成过程中更为动态但不会变短，并提出了微管迁移的可能机制是寻找和捕获＂.微管的
动态变化是微管骨架在外环境信号传递过程中发挥作用的关键所在［30］，因此，正是可能由于微管的动态没有被GFP－MBD融合蛋白干扰，该种悬浮细胞对外环境变化的应激响应能力也没有改变.
总而言之，GFP－FABD2和GFP－MBD融合蛋白对拟南芥愈伤组织的诱导，悬
浮细胞的形态、生长及活力造成一定影响，而该影响可以通过调整培养条件的激素水平得到缓解.在优化条件下培养的GFP－FABD2和GFP－MBD转基因悬浮细胞对温度、渗透压、机械应力等环境改变的应激响应能力与野生型没有明显差别，可以将其作为研究细胞骨架在应激响应中作用和动态的理想材料.但细胞骨架标记蛋
白对细胞形态、生长等方面影响的激素修复机制还有待进行分子层面的研究，这将有助于深入了解激素在细胞生长过程中的作用.
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