表达蛋白，你用什么系统？BioEngX

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当你决定克隆或者表达某个蛋白质时，你需要考虑使用哪些表达系统。

目前有以下一些可以适用于大规模生产蛋白的表达系统:

大肠杆菌表达系统

用大肠杆菌进行蛋白表达是最简单、最快、最便宜的方法。现在有很多商业和非商业的表达载体可以应用，这些载体通常包含有N-和C-末端的纯化标签。另外，很多菌种已经被优化可用于特定蛋白的表达。

酵母表达系统

酵母菌是一类真核微生物，相比于大肠杆菌，酵母菌有一些较为突出优点。其优点之一就是，酵母菌培养能够达到一个很高的浓度，这使得酵母菌更适用于同位素标记蛋白的表达生产。最常用的两种酵母菌株是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（ Pichia pastoris）。

昆虫细胞表达系统

昆虫细胞是比酵母更高级的真核生命表达系统，能够更好地进行蛋白翻译后的加工修饰。因此，当你想要表达某种哺乳动物的蛋白时，使用昆虫细胞作为表达系统，能够使你有更大的机会去获得可溶性蛋白。使用昆虫细胞表达蛋白的不足之处在于成本较高，而且还需要很长的时间才能得到你的蛋白（通常两周）。

哺乳动物表达系统

很多实验室将HEK(人胚肾)细胞系和CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系，用于表达制备更加复杂的、需要适当翻译后修饰的蛋白。这两个细胞系既可以用于瞬时表达也可以用于稳定系表达。稳定的细胞系表达需

要消耗一定的时间，但也具有更高的生产率以及更少的变异。另外，这些细胞对分泌蛋白具有高表达能力(商业蛋白高达10或100毫克每升，甚至往往几克每升)，但胞内蛋白的表达水平通常都比较低。

如何判断哪种表达系统更利于自己的研究呢？你需要问自己这几个问题:

1. 想要表达什么类型的蛋白?

当你想要表达的是一个原核蛋白时，很明显应该选择大肠杆菌。这个方法迅速价廉，同时大肠杆菌具有针对原核蛋白的所有折叠和翻译后修饰功能。如果是真核蛋白的话，表达方法的选择就取决于更多的因素了（见下文）。

2. 用大肠杆菌表达时能得到可溶性蛋白吗?

鉴于前面提到的种种原因，真核蛋白的表达通常也将大肠杆菌作为首选表达方法。然而，许多真核蛋白在大肠杆菌内表达时不能进行适当的折叠，从而会形成不可溶的聚集体（也称包涵体）。当然有时候，将包涵体溶解，或是通过低温表达蛋白来提高溶解度是有可能实现的。另外，恰当的使用分子伴侣如谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase ，GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)等也可以提高目的蛋白的溶解性。然而与其尝试10种不同的大肠杆菌，不如换用真核表达系统。

3. 表达的蛋白需要翻译后修饰吗？

许多蛋白为了获得相应的活性或是正确的结构，需要在翻译后进行修饰。最简单的一种修饰是发生在所有的生物体中的去除N-末端的蛋氨酸残基。更复杂的修饰，如N/O–糖基化，N/O–磷酸化则只发生在部分真核细胞中。

4. 表达的蛋白用到哪些密码子?

我们知道，在生命体中61个密码子的使用频率是不一样的。有些密码子非常重要，是由于它们出现在高水平表达基因中，而一些低频密码子则出现在低表达水平的基因中。对于不同的生命体，低频密码子也不尽相同，这取决于生命体本身。不同系统使用密码子情况可以在condon usage database中获知（/codon/）。往往，密码子的使

用频率反应了同源tRNA 的数量水平。因此，当你的目的蛋白的密码子用法与宿主的密码子用法不同时，有可能在表达蛋白时会出现问题。下面这些问题经常发生:

• 翻译中止。这会导致一系列片段蛋白的产生。

• 开放阅读框错位（Frame shifting ）。

• 氨基酸的错配。例如，使用AGA 密码子编码精氨酸时，可能会导致赖氨酸与精氨酸之间的替换。AGA 密码子在真核生物中非常常见，但在大肠杆菌中却很少见。赖氨酸替换精氨酸后，会导致蛋白质相对分子量降低28Da ，这是因为赖氨酸的侧链比精氨酸的侧链少了两个N 原子，相对分子量的差别可以通过质谱检测到。

• 抑制蛋白合成或细胞生长。这导致的结果是，观察到的蛋白质表达水平很低甚至根本没有表达。特别是低频密码子出现在mRNA 的5’端或连续出现的情况下（mRNA5’端是翻译开始的位置，这里出现稀有密码子，翻译无法开始），可以观察到蛋白质表达表达水平是非常低的，同时也会观察到片段化的蛋白产物。

要想提高大肠杆菌中含有低频密码子蛋白的表达水平，有以下两个方法:

· 定点突变。在具有相同的残基情况下，用高频密码子去替换低频密码子。如，大肠杆菌中的精氨酸低频密码子AGA, AGG 可以用高频密码子CGC 替换。

· 与编码稀有tRNA 的基因共表达。下面的表格提供了几个可以用于编码多个稀有tRNA 的大肠杆菌菌株

菌株 可提供的稀有tRNA 供应商

BL21 (DE3) CodonPlus-RIL AGG/AGA (精氨酸), AUA(异亮氨酸) and CUA (亮氨酸)

Stratagene BL21 (DE3) CodonPlus-RP AGG/AGA (精氨酸) and CCC(脯氨酸) Stratagene

Rosetta or Rosetta (DE3) AGG/AGA (精氨酸), CGG(精氨酸), AUA

(异亮氨酸) CUA (亮氨酸), CCC (脯氨酸), andGGA

(甘氨酸)

Novagen 利用这些菌株进行基因表达时，你经常会得到完整蛋白和被截断

的片段蛋白的混合物。利用C-末端纯化标记（比如His tag），可以采用亲和层析的方法纯化到完整蛋白。当用上面两种方法来提高蛋白质的表达水平都失败的情况下，就需要考虑改用其他表达系统如酵母菌和昆虫细胞等。如果目的蛋白包含了很多大肠杆菌的低频密码子，最好直接采用真核表达系统。最后我们通过一张表系统的了解不同表达系统的特点。

特点大肠杆菌酵母菌昆虫细胞哺乳动物细胞细胞生长速率快 (30 min) 快 (90 min) 慢(18-24 h) 慢 (24 h)

生长培养基的复杂

程度

简单简单复杂复杂

生长培养基的成本低低高高

表达水平高低–高低–高低–中等

胞外表达情况分泌至周质分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基蛋白折叠通常需要复性可能需要复性正确折叠正确折叠

N-联糖基化无高甘露糖简单，无唾液

酸

复杂

O-联糖基化无有有有

磷酸化无有有有

乙酰化无有有有

酰化无有有有

羰基化无无无有References

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