氧化低密度脂蛋白通过aktmtorp70s6k途径诱导内皮细胞自噬

Oxidized Low Density Lipoprotein Induces Endothelial Cell Autophagy
by Akt / mTOR / p70S6K Pathway
Abstract
Objective Autophagy, which is an evolutionarily conserved process, plays an important role in cells growth, development and homeostasis . Oxidative stress is a well-known stimulus of autophagy that facilitates the removal of damaged material. In this study, we investigated the role of oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) on autophagy and
Akt/mTOR/p70S6K signaling in human umbilical endothelial vein cells (HUVECs). Methods HUVECs were exposed to ox-LDL (100 µg/ml) and isopyknic PBS then collected after 6 h and 12 h. Ultrastructure changes of endothelial cells were examined by transmission electron microscope. The autophagy levels in different groups were measured by the mRNA expression levels of microtubule -associated protein 1 light chain 3 (LC3) and sequestosome 1 (SQSTM1/p62), which were assayed by quantitative
RT-PCR. The protein expression levels of LC3, p62, P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、
P-p70S6K /p70S6K were investigated by Western blot.
Results1.Ultrastructure changes in cells were examined with transmission electron microscope at 6 h and 12 h post ox-LDL treatment. E M images showed normal cytoplasm, mitochondria, nucleus, and chromatin in control HUVECs, while few or no autophagosomes and lysosomes were observed. In contrast, the E M images from ox-LDL-treated HUVECs displayed many autophagosomes at various developmental stages which demonstrated that ox-LDL could induce autophagy in HUVECs. The number of autophagosomes at 6 h was considerably higher than those at 12 h.
2. The detection of LC3-II is used as a marker of autophagy activation. Compared to the control group, the treatment group showed increased the mRNA and protein level of
LC3-II (P＜0.05) and decreased the level of p62 (P＜0.05). Additionally, p62 interacts with the autophagic effecter protein LC3 and is degraded through the
autophagy–lysosomal pathway.
3. Ox-LDL inhibited the phosphorylated protein expression levels within the Akt
/mTOR/p70S6K signaling pathway (P＜0.01). However, the effect of ox-LDL on the Akt /mTOR /p70S6K signaling pathway did not affect the total protein expression levels of Akt, mTOR and p70S6K.
Conclusion In the present study, we provided evidence suggesting that ox-LDL (100
µg/ml) could induce autophagy in HUVECs. In particular, our study demonstrated that the number of autophagosomes was significantly increased after 6 h and 12 h in HUVECs treated with ox-LDL. In contrast to the control group, the mRNA and protein expression level of LC3-II was up regulated while the level of p62 was down regulated in the
ox-LDL treatment group. This effect was more significant in the 6 h treatment group than in the 12 h group. Moreover, the phosphorylated protein expression levels within the Akt /mTOR/p70S6K signaling pathway was down regulated. Based on this, we imply that
ox-LDL induces autophagy in HUVECs by inhibiting the Akt/mTOR/p70S6K signaling pathways.
Postgraduate student: Li Ting (Neurology)
Directed by Prof. : Xu-Dong Pan Keywords Ox-LDL; LC3; SQSTM1/p62; mTOR; Autophagy
目录
引言 (1)
实验材料 (2)
1.1实验细胞 (2)
1.2主要试剂 (2)
1.3主要仪器 (2)
1.4液体及试剂配制 (3)
实验方法 (5)
2.1细胞培养及分组 (5)
2.1.1细胞培养 (5)
2.1.2分组 (5)
2.2细胞复苏和冻存 (5)
2.2.1细胞复苏 (5)
2.2.2细胞冻存 (6)
2.3细胞传代 (6)
2.4反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测M RNA表达 (7)
2.4.1细胞总RNA的trizol法提取 (7)
2.4.2将总RNA从样品逆转录成cDNA (8)
2.4.3实时定量RT-PCR (9)
2.5．细胞蛋白的提取、定量及W ESTERN-B I OTTING检测 (9)
2.5.1细胞总蛋白的提取 (9)
2.5.2配制浓缩胶和分离胶 (10)
2.5.3上样及SDS-PAGE 凝胶电泳 (10)
2.5.4 转膜 (10)
2.5.5 封闭 (11)
2.5.6孵育抗体 (11)
2.5.7 显色 (11)
2.5.8条带分析 (11)
2.6透射电镜观察 (11)
2.7统计学方法 (12)
实验结果 (13)
3.1.O X-LDL诱导HUVEC S自噬的电镜表现 (13)
3.2.O X-LDL对HUVEC S中LC3、P62表达的影响 (13)
3.3.O X-LDL对HUVEC S中A KT/M TOR/P70S6K信号通路表达的影响 (14)
讨论 (16)
结论 (18)
参考文献 (19)
综述 (22)
综述的参考文献 (28)
攻读学位期间的研究成果 (34)
缩略词表 (35)
致谢 (36)
学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 (37)
引言
引言
动脉粥样硬化(atherosclerosis AS)是一种复杂的炎症性和代谢性疾病，在世界范围内，它是导致人类发病率和死亡率增高的主要原因之一。

脂蛋白与内皮细胞之间的关系在AS的发生、发展中有着密切的联系[1]。

内皮细胞损伤可由各种因素引起，比如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），其可以抵抗蛋白酶系统的降解，导致脂质积聚和泡沫细胞形成，从而损伤内皮细胞导致动脉粥样硬化的发生，因此被认为是内皮细胞损伤的重要危险因素[2-4]。

同时，在氧化应激期间，血管中超氧化物的增加促进LDL的氧化并产生更高量的ox-LDL，这对内皮细胞的功能产生进一步的不利影响[5]。

自噬，是一个在生物进化上相对保守的过程，在细胞的生长、发育、稳态平衡中发挥重要的作用[6]。

自噬通过去除细胞内受损的细胞器、生物合成过程中的畸形蛋白质和一些非功能性长寿蛋白质，从而对细胞具有保护作用。

然而，毫无控制的自噬可导致细胞死亡[7]。

LC3和p62是两个众所周知的自噬标记物，LC3，作为酵母ATG8的哺乳动物同源基因，已经在自噬体内膜上被鉴定，并且已经被提议用作选择性底物p62 / Sequestosome 1（SQSTM1）的受体，p62/SQSTM1与LC3结合，优先被自噬降解[8, 9]。

氧化应激可以诱导细胞自噬，从而促进细胞内受损物质的降解。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信号通路在AS发生、发展中发挥关键的调节作用[10]。

既往研究指出，选择性的抑制PI3K/Akt/mTOR 信号传导通路，可通过诱导巨噬细胞发生自噬，减少了斑块中巨噬细胞的数量，从而使动脉粥样硬化易损斑块趋于稳定[11]。

Ox-LDL，动脉粥样硬化中的主要危险因素之一，在THP-1巨噬细胞和兔股动脉的血管平滑肌细胞中，ox-LDL可以活化mTOR，抑制自噬，促进泡沫细胞的形成，导致AS发生[12]。

有研究表明，ox-LDL通过增加ATG13的总蛋白水平和抑制血管内皮细胞中的ATG13蛋白磷酸化，抑制mTOR，诱导自噬[10]。

因此，我们的研究旨在探讨ox-LDL是否通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导内皮细胞自噬。

实验材料
1.1实验细胞
附属医院及伦理委员会相关条例规定执行。

1.2主要试剂
⑴DMEM培养基：购自美国Hyclone公司。

⑵四季青胎牛血清：华晟生物科技有限公司（青岛）。

⑶氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）：广州奕源生物科技有限公司。

⑷Trizol试剂：购自日本TaKaRa公司。

⑸0.25﹪胰蛋白酶：购自北京索莱宝科技有限公司。

⑹双抗青链霉素混合液：购自北京索莱宝科技有限公司。

⑺RNA逆转录试剂盒：购自日本TaKaRa公司。

⑻实时荧光定量PCR试剂盒：购自日本TaKaRa公司。

⑼RT-PCR合成的引物：生物工程公司（上海）。

⑽BCA蛋白浓度测定试剂盒：晶美生物工程有限公司。

⑾提取蛋白的试剂盒：购自碧云天公司。

⑿SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒：购自碧云天公司。

⒀ 0.45μm PVDF 膜（聚偏二氟乙烯膜）购自北京索莱宝生物科技有限公司；
⒁单克隆抗体LC3-II (D11), p62(SQSTM1), P-Akt(Ser473), Akt(C67E7), P-mTOR (Ser2448), mTOR (7C10), P-p70S6K (Thr421/Ser424), p70S6K (49D7)：购自美国CST公司。

⒂其它生化试剂：常规试剂如异丙醇、乙醇、75%医用酒精等均购自广州华晟生物科技有限公司。

1.3主要仪器
(1)实时荧光定量PCR仪器：FTC-3000, Funglyn Biotech 加拿大；
(2)反转录仪：天根生物科技（北京）有限公司；
(3)低温超速离心机（Heal Force）：Eppendorf5417R 德国；
(4)细胞培养箱：Thermo公司，美国；
实验材料
(5)透射电子显微镜：H-7650, HITACHI ；
(6)蛋白电泳仪、电转仪：美国Bio-Rad 公司；
(7)TS-92万向摇床：海门市麒麟医用仪器厂；
(8)RNA 分析仪：Dynamica ；
(9)超净工作台：SW-CJ-2FD ，苏州净化设备有限公司；
(10)转移电泳槽: DYZ ．40B,北京市六一仪器厂。

(11)光学显微镜：Olympus BX51, Olympus ；
(12)-80℃超低温冰箱：MDF-38IE ，SANYO ；
(13)4℃冰箱：BCD-232，青岛澳柯玛集团；
(14)涡旋振荡器：莱伯特 美国；
(15)电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9240A ，上海精宏公司；
(16)离心机：Dynamica-V18R-2型，天美科学仪器有限公司；
(17)电子天平：MP200A,上海精科仪器厂；
(18)电热恒温水浴锅：HHSY11-NI ，北京长风公司；
(19)制冰机：SIM-F-124，SANYO ；
(20)纯水系统：Milli-Synthesis, Millipore ；
(21)可调式微量移液器（1 ml 、200 ul 、10 ul ）：德国Eppendorf 公司生产；
(22)高温杀菌锅：SX-500，日本日立公司；
1.4液体及试剂配制
⑴PBS （500 ml ）
NaCl 4g
KCL 0.1g
Na 2HPO 4·12H 2O 1.79g
KH 2PO 4 0.12g
ddH 2O 80 ml
滴加盐酸调节PH 值为7.4，进行高温灭菌
⑵10% SDS
称取10g SDS 溶于100 ml ddH 2O 中，用盐酸调定PH 值为7.2，加热搅拌使其充分溶解。

⑶30% 聚丙烯酰胺
Acr （聚丙烯酰胺） 29.2g
Bis-acr （N-N 亚甲叉双丙烯酰胺） 0.8g
ddH 2O 80 ml
调节pH<7．0，使其充分地溶解，剩余的用ddH
O补足至100 ml，于46℃棕色瓶中避
2
光保存。

(4) pH 8．8的1．5M Tris·HCl 100 ml
Tris 18.17g
ddH
O 80 ml
2
O定容至100 ml。

滴加HCl调节pH值至8．8(约2．5m1)，再加ddH
2
(5) pH 6．8的1．0M Tris-HCL 100 ml
Tris 12．11g
O 80 ml
ddH
2
O定容至100 ml。

滴加HCl调节pH值至6．8(约8m1)，再加ddH
2
(6) 10％过硫酸胺(APS)
O内。

100 mg APS使其充分溶解于1 ml ddH
2
(7) PH 8．3的5×Tris.甘氨酸电泳缓冲液 1000 ml
Tris 15．1g 1×配方Tris 3．02g
Glycine 94g Glycine 1 8．8g
10％SDS 50 ml(或SDS 5g) 10％SDS 10 ml(或SDS 1g)
(8) PH 8．3的转膜缓冲液1000 ml
Tris 3．0 g
Glycine 1 4．4g
SDS 1．0g
O 750 ml
ddH
2
O补足至1000 ml 加200 ml甲醇，调pH 8．3，在容量瓶里加ddH
2
(9) 10×TBS洗膜缓冲液(pH 8.0)
NaCl 80g
Tris 24．2g
O 900 ml
ddH
2
O定容至1000m1．
加ddH
2
(10) 1×TBST：量取100 ml 10×TBS，在上述的TBS中加入20 ml Tween-20，
O定容至1000 ml，滴加HCl调节pH值至7．6。

再加ddH
2
(11) 5％封闭液：将脱脂奶粉溶于80 ml 1×TBST，在室温下溶解。

(12) DEPC水(O．01％v/v)10 ml：DEPC 1 ul加至10 ml ddH
O中，充分震荡后，在4℃
2
下冷藏备用。

实验方法
实验方法
2.1细胞培养及分组
2.1.1细胞培养
(1)实验开始前30分钟用紫外线对实验室及超净台进行消毒；
(2)关紫外线，进行通风30分钟后，进入细胞培养室；
(3)用酒精对实验台、双手及试剂瓶进行消毒；
(4)对细胞培养瓶瓶口及瓶盖进行消毒，同时，注意避免盖错瓶盖导致的交叉污染；
(5)将瓶内的培养液吸出，同时，使瓶口远离废液池，以防被污染；
(6)用一次性吸管将PBS注入到培养瓶中，小心冲洗，注意不要划伤细胞；
(7)轻轻摇晃培养瓶，除去瓶内的死细胞及其它代谢产物，将PBS吸出；
(8)用吸管将5 ml完全培养液注入瓶内，并盖好；
(9)置于培养箱中；
(10)每天观察细胞生长状态
2.1.2分组
按上述步骤培养，24小时后换液继续培养，并注意观察细胞生长情况，选用第四代HUVECs，以10*10^4/ml的细胞密度接种于六孔板中，每个孔内接种2ml，然后取对数生长期的细胞，分为ox-LDL组和对照组，分别加入100ug/ml ox-LDL和等体积的磷酸盐缓冲液（PBS），于6h、12h后, 收集细胞。

2.2细胞复苏和冻存
2.2.1细胞复苏
一、实验前准备：
(1)将水浴锅预热至37℃；
(2)酒精及紫外线消毒超净台30分钟；
(3)于超净台摆好已消毒的吸管、培养瓶、离心管。

二、取出冻存管：
于液氮箱中取出装有HUVECs的冻存管。

三、迅速解冻：
(1)将冻存管置于37℃水浴锅内进行摇动使其解冻；提前配好配完全培养基：向离心管中加入DMEM、10%胎牛血及双抗，比例是9:1:0.1。

(2) 2分钟后管内液体充分溶解，用酒精消毒管外壁，置于超净台中。

四、将管内液体置于离心管内，加入5 ml完全培养基，配平后低速离心，转速
=1000prn，时间=4 分钟。

制备细胞悬液：
(1)弃上清；
(2)吸取5 mL完全培养基置于装有离心之后细胞的离心管中，使其重悬，以充分混匀。

五、培养细胞
使符合细胞计数标准的细胞悬液分别装入培养瓶中，将其放入37℃和含5％CO2的培养箱中培养。

24小时后换液继续培养，并注意观察细胞生长情况。

2.2.2细胞冻存
(1)制备含10% DMSO、20%胎牛血清的冻存培养液4 mL（血清浓度越高越利于细胞的存活，其它用DMEM补足）
(2)取出生长良好的细胞
(3)吸除旧的培养液：用酒精灯外焰过火灭菌吸管，将培养瓶倾斜，吸出其中的培养液，丢弃吸管至废液池内
(4)消化：将吸管于酒精灯外焰过火灭菌，取0.25%胰蛋白消化酶 1 ml，使其充分混匀，将培养瓶置于37℃消化。

(5)中和：取出培养瓶置于显微镜下观察HUVECs的被消化程度，待其被完全消化后，向其中注入2ml完全培养基，终止消化。

(6)离心收集细胞：配平后离心，1000 prn 4 min。

(7)分装冻存：1 ml细胞分装进冻存管内。

（一瓶冻存一管，细胞浓度高有助于后续的细胞复苏）
(8)于管壁上标记细胞名称、时间及冻存者；
(9)冻存：冻存盒内含异丙醇，可直接置于-80℃冰箱内暂存，然后-196℃液氮保存。

没有冻存盒可以4℃30 min，-20℃1-2小时，一般不超过2小时，然后， -80℃冻存。

2.3细胞传代
一．实验前准备工作：
带上手套，75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精；将所需的试验材料（如透气的培养瓶、离心管、一次性吸管）置于消毒柜内，紫外线照射消毒超净台
30分钟；将细胞培养液置于37℃水浴锅中预热。

二．准备实验：
先关闭紫外等30 min后再进行实验；用酒精擦拭超净台、消毒，点燃酒精灯，从培养箱内取出细胞。

(1)吸除旧的DMEM培养液：用酒精灯外焰过火灭菌吸管，将培养瓶倾斜，吸出其中的培养液，丢弃吸管至废液池内。

向瓶内注入2ml PBS，轻轻吹洗细胞数次。

(2)消化：将吸管置于酒精灯外焰过火灭菌，吸取1 ml 0.25%胰蛋白消化酶注入培养瓶中，使其充分混匀。

(3)中和：于显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆、连接断开，成为单个细胞时，注入2倍的 DMEM完全培养液终止消化。

反复吹打混匀；吸出瓶内的溶液至离心管内。

(4)离心收集细胞：配平后离心，转速=1000 prn，时间=4 min。

(5)重悬细胞：离心后吸出中和液。

注入新鲜的DMEM完全培养液，反复吹打，使其充分混匀，尽可能避免气泡的产生。

(6)分装：以每瓶5 mL容积细胞悬液分装置入培养瓶中，使其充分混匀，做好相关标记；
培养箱内培养。

(7)培养：把细胞置于37℃ ，含5% CO
2
(8)观察：每天观察细胞生长状态，做好相关记录。

2.4反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA表达
2.4.1细胞总RNA的trizol法提取
收集6孔板的细胞，将旧的培养基倒掉，用冷PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入1 ml Trizol 于6孔板的每个孔中，轻轻吹打细胞，取已加好trizol的细胞，氯仿（200 ul/ml trizol），用力摇15s，静置2-5 min，12000r/min，4℃,15 min，取上清（一般300 ul左右，不要贪多），预冷异丙醇（与上清等体积）摇匀，15-30 ℃孵育样品10 min，12000r/min，4℃,10 min，弃上清，加DEPC水配制的75 ％乙醇500 ul，洗涤沉淀，7500r/min，4℃,5 min；弃乙醇，倒扣在滤纸上，空气或真空干燥5-10 min（不要完全干燥），0.1 ％DEPC水10 ul溶解RNA（DEPC水的量视RNA沉淀物的多少而定），溶解完全的RNA样品可直接测浓度用于反转录，亦可置于-80 ℃暂存。

测定RNA的纯度和含量，所提取RNA用紫外分光光度仪检测，要求达到如下条件：计算出OD260／OD280=1．8-2．O。

2.4.2将总RNA从样品逆转录成cDNA
按照PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser RR 047A试剂盒说明书将提取的总RNA进行去除基因组DNA反应，每组取1 μg总RNA于无Rnase的Ep管中，按照步骤1中的体系进行去除基因组DNA反应反应，反应条件设定为：42℃，2 min（或者室温5 min）。

去除基因组DNA后的总RNA直接进行反转录。

轻轻吹打混匀，并轻微离心5s；混匀后放于反转录仪中，按照步骤2中的体系进行反转录反应，反应条件为37℃15 min，85℃5 sec，停止反应，取出cDNA反应产物。

（配制过程在冰上进行）
步骤1：去除基因组DNA反应体系
在42℃，2 min（或者室温5 min）下，进行去除基因组DNA反应
步骤2：反转录反应体系
在冰上进行反应液的配制
2.4.3实时定量RT-PCR
实时定量PCR技术检测人的LC3、p62、GAPDH mRNA。

（1）引物设计：
基因引物
LC3 F：5–AATCCCGGTGATAATAGAAC-3
R: 5–TTTCATCCCGAACGTCTCC-3
p62 F: 5-TGCCCTCTTCTGTCCATAGT-3
R: 5-CACTTGTTTTGCTGCCCTAAAT-3
GAPDH F: 5-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3
R: 5-AAATGAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3
（2）PCR反应体系：
试剂使用量
SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×） 12.5 ul
PCR Forward Primer（10 uM） 0.5 ul
PCR Reverse Primer（10 uM） 0.5 ul
DNA模板（<100 ng） 2 ul
ddH2O（灭菌蒸馏水） 9.5 ul
Total 25 ul
（3）PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，循环40次。

样本中目的基因的计算方法为2^-△△ct，分析LC-3、p62及GAPDH的mRNA相对含量。

每个样本重复上述条件3次。

2.5．细胞蛋白的提取、定量及Western-bIotting检测
总Akt、总mTOR、总p70S6K、磷酸化Akt(P-Akt)、磷酸化mTOR(P-mTOR)、磷酸化p70S6K (P-p70S6K)及LC-3、p62蛋白及GAPDH蛋白表达。

2.5.1细胞总蛋白的提取
根据使用量，每取1 ml RIPA细胞裂解液加入10 ul PMSF(苯甲基磺酰氟)，10 ul蛋白磷酸酶抑制剂.混匀备用（现加现用）；去除旧培养液， PBS轻轻地清洗，每个孔内注入200 ul裂解液，用移液枪轻轻地吹打数次，充分混匀，放置于冰上裂解30分
钟。

2-3个孔收到一个ep管中，然后将其10000-14000转，离心3-5分钟，取上清。

用BCA法测定蛋白浓度，然后加上样缓冲液。

将加过上样缓冲液的蛋白标记组号，-80℃冻存。

2.5.2配制浓缩胶和分离胶
LC3-II分子量大小为14 kDa , p62(SQSTM1) 分子量大小为60 kDa, P-Akt分子量大小为60 kDa, Akt分子量大小为60 kDa, P-mTOR分子量大小为289 kDa, mTOR分子量大小为289 kDa, P-p70S6K分子量大小为70 kDa, p70S6K分子量大小为70 kDa，选择浓度为12%的分离胶，5%浓缩胶。

将配好的分离胶灌入垂直板内，加入异丙醇压胶，静置40 分钟，吸出异丙醇，灌入浓缩胶，并插入样品梳，保证插入样品梳后浓缩胶中无气泡，静置30 分钟。

拔出梳子，待用。

配置12%分离胶配制5%浓缩胶
30%丙烯酰胺 4 mL 0.5 mL
1.5M/L Tris-HCl(Ph 8.8)
2.5 mL 0
1.0M/L Tris-HCl(Ph 6.8) 0 0.38 mL
10% SDS 100 μL 30 μL
10%过硫酸胺 100 μL 30 μL
TEMED 4 μL 3 μL
双蒸水 3 mL 2.1 ml
总体积 10 ml 3 ml
2.5.3上样及SDS-PAGE 凝胶电泳
安装电泳槽，槽内倒入电泳液，保证电泳槽安装后无漏液，在泳道上分别加入marker 和蛋白样品，每个泳道加入12 μL样品，进行不连续电泳。

电泳条件为：浓缩胶80 V，分离胶120 V，待溴酚蓝条带到达分离胶的底部，终止电泳。

2.5.4 转膜
按照marker 显示范围剥离凝胶，用电转液平衡20 min。

用甲醇活化PVDF膜5 min，再浸于电转液中平衡10 min。

按照滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸顺序做成三明治结构
（注意赶走每两层之间的气泡），将上述结构放到半干转膜仪的阳极和阴极板之间，转膜电压12 V转膜30 min。

2.5.5 封闭
用TBST缓冲液配制含5% BSA的封闭液，将转膜后的PVDF膜与配制好的封闭液室温封闭2.5 h。

2.5.6孵育抗体
准备好所要孵育的抗体及其稀释度，配好5%的脱脂奶粉，按要求稀释好一抗（LC3-II、p62、Akt、mTOR、p70S6K 1:1000；GAPDH 1:1000 ），将已稀释完毕的一抗与膜孵育，置于室温下孵育2 小时，置于4 ℃冰箱内过夜；弃一抗，用TBST 洗膜3次，每次10 min。

孵育一抗完成后，用PBST或TBST漂洗膜之后，再洗膜3次，每次10 分钟；加二抗（LC3-II、p62、Akt、mTOR、p70S6K 1:5000；GAPDH 1:5000 ），室温下孵育2 h；用PBST或TBST漂洗膜后再洗膜3次，每次10 min。

2.5.7 显色
将ECL 试剂盒中A、B 试剂1:1 混合，均匀涂在PVDF 膜上，1 min，利用化学发光方法进行图像扫描，显影，保存图像。

2.5.8条带分析
Image J软件计算灰度值，目的蛋白与内参进行比较，然后按照相对灰度值统计分析。

2.6 透射电镜观察
在ox-LDL（100ug/ml）处理6小时、12小时后，将细胞用3％戊二醛在4℃固定24小时，然后用1％锇酸固定，在梯度乙醇（50％，70％，80％，95％，100％，每15分钟）和丙酮（两次，每次15分钟）脱水后，通过环氧树脂包埋细胞，使用超薄切片机（德国MEDITE 公司）制备超薄切片，然后用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。

然后，在透射电子显微镜（H-7650, HITACHI）下观察切片并拍照。

2.7 统计学方法
应用SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料以Mean±SEM表示。

多组比较选择单因素方差分析，两两比较选用LSD-t法。

P＜0.05为差异有统计学意义。

实验结果
3.1. Ox-LDL诱导 HUVECs自噬的电镜表现
经ox-LDL（100ug/ml）处理HUVECs 6小时和12小时，后用透射电子显微镜检查细胞的超微结构变化。

透射电镜显示，对照组细胞核膜完整，染色质结构正常，胞浆内各细胞器、细胞核形态和分布基本正常，未见明显自噬空泡，溶酶体数目未见明显增多（图1a）。

相比之下，Ox-LDL(100ug/ml)作用于HUVECs 6h、12h后，细胞质中可见包含部分细胞质内成分双层膜结构的自噬体，表明ox-LDL可诱导HUVECs发生自噬。

自噬体可能源自无核糖体内质网分离的膜。

这些分离的膜伸长，在两端弯曲以形成C形结构和双膜液泡。

当自噬体与溶酶体融合时，内膜消失，自噬体变成单膜自噬泡。

电镜照片显示双膜自噬体（图1b，如白色箭头所示）和溶酶体（图1b-c，如黑色箭头所示）。

并且，6h处理组中的自噬体数量高于12h处理组（图1 b、c）。

图1 Ox-LDL诱导HUVECs 6、12h后自噬体的透射电镜变化
HUVECs经ox-LDL（100ug/ml）处理 6h（图1b）、12h（图1c）后，与对照组相比（图1a），6h时间点，自噬小体数量明显增多，出现双层膜结构（白箭头所示）和部分自噬溶酶体（黑箭头所示）；12h时间点，包裹细胞器的自噬溶酶体出现在细胞质中（黑箭头所示）；标尺为500nm
3.2. Ox-LDL对HUVECs中LC3、p62表达的影响
LC3-II的检测作为自噬激活的标志物。

处理组细胞显示LC3-II的mRNA和蛋白表达水平增加（P＜0.05，图2a）。

此外，我们发现处理组细胞中p62的mRNA及蛋白表达水平降低（P＜0.05，图2b）。

表明，p62与LC3存在相互作用，并通过自噬溶酶体途径降解。

图2 Ox-LDL诱导HUVECs 6、12h后LC3、p62 mRNA及蛋白变化
经ox-LDL处理HUVECs 6、12h后，LC3-II蛋白表达上调（图2a），p62蛋白表达下调（图2b），且6h变化更显著；对照组和经ox-LDL处理后6h、12h HUVECs中LC3-II mRNA 及蛋白表达（图2a），p62 mRNA及蛋白表达（图2b）.*P＜0.05，差异有统计学意义。

3.3. Ox-LDL对HUVECs中Akt/mTOR/p70S6K信号通路表达的影响
自噬的分子机制研究已经揭示，调控自噬的生物学分子是多样的，包括ERK1 / 2，AMP激酶，I类和III类PI3K，Akt和mTOR等。

我们的研究集中在Akt/mTOR /p70S6k途径。

在我们的实验中，选择6小时作为研究ox-LDL与Akt/mTOR/p70S6k信号传导通路之间关系的时间点。

我们发现ox-LDL抑制了Akt，mTOR及其下游靶物p70S6K的磷酸化蛋白的表达水平（P＜0.01 图3）；总Akt，总mTOR和总p70S6K在两组中没有明显的变化。

图3 Ox-LDL对Akt/mTOR/p70S6K信号通路相关分子影响的Western blot 分析Western blot用于ox-LDL（100ug/ ml）处理HUVECs，后对细胞中P-Akt/Akt、
P-mTOR/mTOR、P-p70S6K /p70S6K表达水平的分析。

结果显示，总Akt，总mTOR和总p70S6K在两组中没有明显的变化，而与对照组相比，处理组细胞中Akt，mTOR和p70S6K
的磷酸化水平降低。

讨论
在本研究中，我们提供证据表明ox-LDL（100ug/ml）可以诱导HUVECs发生自噬。

并且，我们的研究证明在ox-LDL处理HUVECs 6小时和12小时后自噬体的数量显著增加。

与对照组相比，LC3-II的mRNA和蛋白表达水平上调，而ox-LDL处理组中p62的水平下调。

这种效应与12小时处理组相比，6小时处理组中的作用更为显着。

我们的研究结果显示，在HUVECs中，ox-LDL通过抑制Akt/mTOR/p70S6K途径激活自噬。

自噬是一个在生物进化上相对保守的过程，涉及长寿蛋白的降解[13]。

它在细胞的生长、发育、稳态平衡中发挥了重要的作用[6]。

基础水平的自噬活动代表修复以及维持生命活动的过程，但毫无控制的自噬活动会导致细胞的死亡[14]。

自噬溶酶体途径是清除错误折叠蛋白质和细胞碎片的主要机制。

自噬通过清除细胞内变性蛋白的聚集和受损的细胞器，具有细胞保护的作用，从而可以维持基础能量平衡[7, 15]。

自噬的失调可能导致许多疾病包括AS [16]。

一些研究表明自噬在AS中的保护作用[17, 18]。

自噬缺失可通过氧化损伤[19]和炎症因子释放促进AS的发生[20]。

自噬过程涉及多个基因，其中比较重要的是微管相关蛋白LC3和p62蛋白。

LC3是自噬体形成的重要形式，它是最容易辨别的哺乳动物蛋白种类，且参与自噬体双层膜的形成[21]。

当自噬被诱导时，LC3-I和丰富的膜磷脂即磷脂酰乙醇胺相互作用产生了LC3-II，LC3-II是自噬的主要蛋白[22]。

p62蛋白和经泛素化的蛋白结合，然后再与LC3-II蛋白相结合形成复合物，最终会在溶酶体内降解，随着自噬活动进程的不断推移，p62蛋白会不断被消耗[8, 9]。

内皮细胞损伤是AS发生的启动环节，氧化应激在AS病理过程中发挥着重要的作用[23]。

低密度脂蛋白（LDL）浸润到内皮下，其中缺乏血浆抗氧化酶，经氧化修饰为ox-LDL，后者抑制一氧化氮合酶，诱导粘附分子表达，产生活性氧，并导致内皮细胞凋亡和泡沫细胞形成[24]。

同时，氧化应激可以诱导内皮细胞自噬，从而促进受损细胞器的降解，保护内皮细胞免受损伤[25, 26]。

Ox-LDL与自噬的关系非常密切，因此，在我们的研究中，ox-LDL被用于氧化应激诱导HUVECs自噬模型的建立。

越来越多的证据表明大多数自噬是由氧化应激引起的保护机制，它可以调动细胞内能量储存、使受损的细胞器得以循环，为细胞提供营养物质[27]。

因此，自噬被认为是一种应激反应，可能通过调节能量稳态或通过蛋白质和有机物降解，允许真核生物在恶劣的条件下（营养缺乏，缺氧，氧化应激，暴露于外源物）生存[26, 28]。

LC3-II 是自噬体增加的标志物[29]，而p62表达与自噬通量呈负相关[9]。

在研究中，我们发现LC3-II的mRNA及蛋白表达水平上调，p62的的mRNA及蛋白表达水平下调。

上述结果表明在ox-LDL干预下，HUVECs的自噬活动被激活。

此外，电镜结果显示处理组细胞中
讨论
自噬体数目增多，更进一步证明了自噬被激活。

其中，在ox-LDL处理HUVECs后，6h 时间点的作用最显著。

磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族的丝氨酸/苏氨酸激酶作为雷帕霉素（TOR）的靶点，并且从酵母到哺乳动物中均具有高度的保守性[30]。

TOR作为细胞生长的中心调节剂，受多种信号调节，包括生长因子、营养物质和氧化应激等。

哺乳动物细胞中的研究已经确定了两种不同的TOR复合物，TORC1和TORC2，其磷酸化不同的底物并且具有不同的生理功能。

TORC1通过调节多个包括转录，翻译，核糖体生物合成和自噬来调控细胞生长。

此外，TORC1可直接磷酸化S6K的Thr389，其对于S6K激酶的活性是必需的，S6K反过来磷酸化核糖体S6蛋白。

TORC2具有调节细胞形态和细胞骨架重组的作用，并且对雷帕霉素不敏感[31]。

AKT [也称为蛋白激酶B（PKB）]已显示作用于TORC1的上游，并间接刺激TORC1活性[32]。

mTOR负调节自噬，特别是mTORC1 [33, 34]。

此外，研究表明ox-LDL可抑制mTOR及其下游靶物p70S6K和4E结合蛋白1（4EBP1）的磷酸化[10]。

为了进一步考证ox-LDL诱导HUVECs发生自噬的机制，我们的研究集中于Akt / mTOR / p70S6K信号传导通路。

因此，我们选用6小时作为我们主要研究的时间点，并且，测定Akt / mTOR/p70S6K信号通路及相关的分子蛋白表达，我们发现ox-LDL降低了p-Akt 蛋白的表达水平，其可以调节下游mTOR，p70S6K，在磷酸化蛋白水平观察到p-mTOR 和p-p70S6K降低，通路受到抑制，从而诱导HUVECs发生自噬。

基于此，我们研究结果表明ox-LDL通过抑制Akt / mTOR /p70S6K信号通路诱导HUVECs发生自噬。

综上所述，ox-LDL可以诱导HUVECs发生自噬，并且这种作用至少部分是在于其抑制Akt/mTOR/ p70S6K信号通路。

在未来的实验中，我们将对其进行深入的研究与探讨，本实验为探究ox-LDL在内皮细胞自噬过程中发挥的作用及机制而提供理论依据。