主要农作物QTL定位和克隆研究进展

主要农作物QTL定位和克隆研究进展
摘要：随着遗传图谱的日趋饱和QTL定位分析方法的日益完善，近年来农作物QTL的研究发展非常迅速。

本文首先从总体上对水稻、玉米、小麦、棉花、大豆这几个农作物的QTL定位作了简要的介绍，然后详细介绍了番茄、水稻、玉米被克隆出的几个QTL的克隆过程及基因功能，对整个QTL的分析方法作了系统的介绍。

关键词：QTL、定位、克隆、基因
作物的许多农艺性状和经济性状是数量性状,研究作物数量性状的遗传对农作物育种具有十分重要的意义。

近几年，作物QTL定位和克隆发展迅速，本文详细阐述了主要农作物近几年的发展状况。

1.QTL定位研究进展
QTL定位是检测分子标记和QTL间的连锁关系,估计QTL的效应利用分子标记进行遗传连锁分析,检测出QTL。

分子遗传学的发展和RFLP,RAPD,SSR,AFLP等分子标记技术的完善,加上日趋饱和的遗传图谱为工具和日益完善的QTL定位分析方法,已在许多作物上定位了不少QTL,并分析了各QTL的效应。

1.1 水稻
水稻QTL的研究近年来发展非常迅速,已进行QTL定位的性状很多。

自Wang等[1]利用RFLP连锁图定位了水稻对稻瘟病有部分抗性的14个QTL以来,有关水稻QTL 定位的研究报道不断增加.目前,世界各国的科学家应用不同的群体,对水稻大多数性状进行了QTL定位,这些性状包括水稻的生育期、株高及其组成性状、产量及产量构成性状、谷粒外观品质、食味和营养品质等农艺性状、以及水稻种子的休眠性、水稻叶片叶绿素和过氧化氢含量等生理性状。

目前的数据表明水稻遗传图谱上的分子标记数已超过6000个,平均间距为75-100 kb,基本覆盖了水稻基因组的所有区域，为进一步精细定位及克隆提供了便利。

1.2玉米
玉米的许多产量相关性状[2]，如穗长、穗粗、行数、行粒数等，国内外都进行了较为深入的研究，定位了大量的QTL位点，并分析了它们的遗传规律，为玉米育种提供了很好的指导意义。

对于农艺性状，只有株高的研究十分深入，而穗位高、茎粗、雄穗分支数、抽雄期、吐丝期这几个重要的农艺性状，总体上的研究都不够深入。

玉米上已鉴定出的控制抗虫性的主基因不多，惟一的例子是spodoptera frugiperda的mirl基因(位于第6 染色体上)。

玉米的种子休眠性、抗穗粒腐病、叶绿素含量也已经进行了初定位。

1.3小麦
与其它作物相比，小麦QTL的研究开始较晚[3]，直到20世纪90年代才见到有相关的报道。

现在小麦中已定位了许多QTL。

在农艺性状方面，由于农艺性状遗传的复杂性，定位的QTL相对较少。

主要集中在株高性状、产量性状、抽穗期、穗部相关性状、籽粒性状等方面。

Kulwal[4]等在小麦3A染色体上定位了1个控制穗芽耐受力的QTL，贡献率为24．68％-35．21％。

许盛宝[5]用188个重组近交系的作图群体，
对群体的抽穗期、株高等性状进行QTL分析，结果表明：影响抽穗期的加性位点有lO个可以解释20．77％的表型变异。

对株高性状的定位，检测到4个位点，可以解释11．95％的表型变异。

Marza等[6]利用RIL群体132个系在3个环境下进行产量性状QTL分析，检测到有10个QTL控制产量性状。

贡献率在7％一23％。

但由于小麦QTL定位多采用初级群体，群体一般较小，导致定位精度不高，因此，关于小麦重要农艺性状的QTL研究还处于起始阶段。

1.4棉花
棉花[7]的分子标记和QTL定位研究虽起步较晚，但进展很快。

目前已筛选、定位了涉及到棉花重要农艺和经济性状包括产量、纤维品质、抗病、形态、生理、早熟性等诸多QTL，为这些性状的标记辅助选择、QTL精细定位及图位克隆奠定了基础。

皮棉产量方面，Ulloa等[8]在陆地棉F2群体中筛选到了2个QTL。

分别解释9．2％和15．7％的表型变异；Wu等121检测到了5个QTL，解释的表型变异为13．8％-42．2。

纤维品质方面，Shappley等[9]检测到了12个纤维品质性状的81个QTL，其中纤维强度6个，麦克隆值15个，纤维伸长率18个，纤维长度7个。

抗病性方面，Wright[10]等鉴定出了7个棉花角斑病Xcm抗性基因QTL，单个水平抗性基因QTL能解释21．3％的表型变异．单个垂直抗性基因能解释93．2％的变异。

在四倍体种的6个抗性基因中，1个为隐性位点，5个定位于D亚组．表明多倍化的形成为进化提供了新的途径．为表型选择提供了新的机会。

1.5 大豆
大豆[11]在农艺性状中共发现了103个QTL。

Boerma等[12]报道了控制大豆株高的QTL有14个,4个QTL。

解释表型变异达到10%以上;在10个控制大豆成熟期QTL中,7个QTL解释表型变异达到10%以上;与倒伏性相关的QTL有10个,其中5个QTL解释表型变异达到10%以上;与裂荚性和种皮硬度有关的QTL均为5个,解释表型变异达到10%以上分别有3个和5个;与开花期有关的QTL有8个,一半解释表型变异达到10%以上;与生育期相关的QTL也有8个,其中5个解释表型变异达到10%以上;与粒重有关的QTL有23个,只有6个QTL解释表型变异达到10%以上;与子粒产量有关的QTL有4个,2个QTL解释表型变异达到10%以上。

2.QTL克隆研究进展
虽然各种农作物QTL定位发展迅速，定位了很多QTL，但是主效QTL被克隆到的却很少。

能到目前为止,已经克隆得到的植物里QTL主效基因有14个,其中水稻5个,番茄3个,玉米2个,拟南芥4个。

这些已克隆的基因都是主效基因,而且只有玉米的控制分枝的基因是通过T-DNA标签法完成的,其余都是通过图位克隆完成的。

2.1番茄QTL的克隆
番茄是最早被QTL克隆的植物。

在番茄中，二个产量相关性状的QTLs通过图位克隆途径被克隆到，它们分别是Brix9—2—5和fw2.2。

2.1.1 Brix9—2—5
埃亚弗里德曼、达尼扎米尔等人[13,14,15]在番茄中克隆了控制番茄果实中可溶性固体物含量的主效QTL Brix9—2—5，该QTL效应值约25%。

他们使用了76个渗入系与栽培种M82杂交，通过分析7000F
单株后用精细作图法定位在质外体转化酶基
2
因(Ⅳ5)中484 bp的区段内。

LIN5在糖分向发育果实转运过程中起重要作用。

该基因编码的蛋白质如发生氨基酸置换，就能改变该酶活性，这正是栽培种和野生种该
酶等位基因之间存在差异的原因。

拥有该基因的品种可以提高蔗糖酶的活性，提高糖分含量。

2.1.2 fw2.2
安妮弗雷里，顿.克林特内斯比特、史蒂芬.坦克斯利等人[16]在番茄中克隆了影
单株后用精细作图法定位在在150kb 响果实大小的主效QTLfw2.2。

通过分析3472F
2
之内，这一基因的结构同人类中的原癌基因c-H-rasp21非常相似。

应用fw2.2上存在差异的NIL料研究发现fw2.2是控制细胞分裂的一个负调节子，在栽培品种和野生种的前期和后期花器官中转录水平都很低，在果实发育过程中，虽然fw2．2 NIL 在细胞大小上没有差异，但细胞分裂方式却互不相同。

fw2.2通过对细胞分裂的调控是果实体积变大。

2.2水稻QTL的克隆
水稻抽穗期性状的QTL精细定位和克隆研究进展较快。

目前已克隆出了5个基因，它们分别是Hd1、Hd6、Hd3a、Gn1a、SKC1。

2.2.1 Hd1
水稻中第一个被克隆的QTL是控制抽穗期的主效基因——Hd1(Yano et a1．，2000)。

Yano等[17]利用超过9000个同样群体的BC3F3，的单株，来克隆Hdl。

他从这个大群体中选出了1 505含有‘‘Kasalath”目标片段的隐性纯合单株在两个RFLP 标记间筛选重组个体，最后Hd1定位于约12Kb的范围内，有2个候选基因，其中一个和拟南芥控制开花期的CONSTANS基因同源，后期研究表明此基因正是Hd1。

Hd1编码一个锌指蛋白，通过与DNA相互作用来影响目的基因的转录活性。

研究者推测Hd1是一个双功能基因，它能够在短日照下提早抽穗，在长日照条件下推迟抽穗。

2.2.2 Hd6
Takahashi等[18]在水稻中克隆了第二个QTL，该基因也与水稻抽穗期有关，是一个光周期敏感基因。

Takahashi所用的材料也是以籼稻Kasalath为供体亲本，粳稻Nipponbare为受体亲本的近等基因系。

他用了2 807个BCrF4单株将Hd6定位于26.4Kb的范围内，该区域仅有1个编码序列。

研究发现Hd6编码一个光周期信号传导途径中的蛋白激酶亚基(CK2a)。

Kasalath所带有的等位基因在长日照条件下能够使抽穗期推迟。

2.2.3 Hd3a
Kojima等[19，20]克隆了水稻中第三个与抽穗期有关的QTL-Hd3a。

将其定位于约20Kb的范围内，该区域有4个候选基因，其中一个cds25与拟南芥FLOWERING LOCUST （FT）基因高度同源。

RT-PCR分析表明，当Nipponbare和其近等基因系NIL(日出曲在16h的长日照条件下，二者都不会抽穗，cds25也不表达；当将它们从16h的长日照环境转移至lOb短日照环境中时，能够诱导抽穗，同时能够检测到cds25表达量的增加。

其余的3个候选基因都不能检测到短日照诱导表达的现象。

将Kasalath 的基因组中含有cds25的片段导入Nipponbare后，转化苗在短日照条件下能够提前抽穗。

2.2.4 Gn1a
Ashikari等[21]克隆了一个和水稻产量相关的QTL。

他们用一个矮秆、高产的籼稻品种Habataki和高秆、低产的粳稻品种Koshihikari杂交，构建的回交重组自交系(BIL)进行QTL定位。

定位了5个与穗粒数相关的QTL和4个与株高相关的QTL，
其中一个控制穗粒数的主效QTL—Gn1贡献率高达44％，被定位于22．6cM的区段内。

为了克隆该主效基因，他们以Habataki作供体亲本，Koshihikari作轮回亲本构建近等基因系，他们用1300个单株的大群体将Gn1定位于6．3Kb的范围内。

Gn1a 是一个编码细胞分裂素氧化酶(OsCKX2)的基因。

这一酶降解植物激素－细胞分裂素。

OsCKX2基因表达量减少会引起细胞分裂素在花器官分生组织中的积累，增加生殖器官的数量，导致籽粒产量增加。

2.2.5 SKC1
任仲海、高继平等与栾升教授[22]进行合作，在国际上首次成功克隆了与水稻耐盐相关的数量性状基因SKCl，并阐明了该基因的生物学功能和作用机理(Ren et a1．，2005)。

他们用一个高耐盐的籼稻品种NonaBokra和一个对盐敏感的粳稻品种
Koshthikari杂交，得到的F
2代群体和F
3
代株系来定位水稻耐盐相关的QTL。

在1
号染色体上定位了一个与茎秆中钾离子浓度相关的QTI广—SKC1贡献率高达40．1％。

为了克隆该QTL，他们用耐盐品种NonaBokra作供体亲本，不耐盐的品种
Koshihikari作轮回亲本构建近等基因系，来精细定位SKCl。

他们用了2 973个BC
3F 2
单株最后将SKCl定位于7．4Kb的范围内，这个区域只含有1个ORF。

该基因编码离子转运蛋白，控制盐胁迫下水稻地上部的钾，钠离子平衡，即维持高钾，低钠的离子平衡，从而增加水稻的耐盐性。

2.3玉米QTL的克隆
玉米QTL得到克隆的主要有两个基因dwarf8和tb1，它们都不是用图位克隆法得到的。

2.3.1 Dwarf8
杰弗里米和爱德华.伯克勒[23]使用候选基因法成功克隆Dwarf8。

使用92个自交系对144个SSR位点作了贝叶斯分析，对Dwarf8的序列多态性与开花时间数量变异进行关联分析，发现这一基因座中编码和非编码区段的几个插入和缺失与开花时间变异显著相关，但引起变异的具体原因还不清楚。

2.3.2 tb1
尼克松克拉克和约翰德布勒[24]通过转座子标签法克隆tb1基因。

他们用2146个单株的大群体将将该基因定位在161 kb的范围。

tb1基因编码一个TCP domain转录因子，对丛生（腋）芽生长实施负调控，在大刍草中的表达水平只有玉米中的50%。

tbl的等位基因变异发生在该QTL的调节区段，结果导致栽培玉米积累的等位基因拷贝数远多于大刍草等位基因拷贝数。

使玉米比大刍草具有更强的顶端优势，抑制分枝发生。

3.展望
研究QTL的定位和克隆对育种有着重要的作用。

对数量性状的分子标记辅助选择技术将是新一轮农业技术革命的一个重要组成部分,它必将对作物的遗传改良作出革命性贡献。

参考文献：
[1] 阮成江,何祯祥,钦佩.我国农作物QTL定位研究的现状和进展[J].植物学通报,2003,20(1):10-22.
[2]汤华，严建兵，黄益勤，郑用琏，李建生. 玉米5个农艺性状的QTL定位[J].遗传学报，2005，32（2）：2-5
[3]杨文利,王立新,张钢民,等. 小麦数量性状分子标记的研究进展[J].生物技术通
报,2003(2):14-21.
[4]Kulwal.N.Kumar.A.Gaur Mapping of a major QTL for pre-harvest sprouting toleranceon chromosome 3A in bread wheat 2005
[5]许盛宝小麦SSR标记遗传图谱构建与株高和抽穗期的QTL定位2005
[6]Marza.G.-H.Bai.B.F.Carver Quantitative trait loci for yield and related traits in the wheat population Ning7840×Clark 2006
[7]董娜，王清连，张金宝，付远志，李成奇，棉花QTL定位及MAS育种进展与展望[J].广东农业科学，2009（6）：24-25
[8]5Ulloa M，Meredith W R．Genetic linkage map and QTL analysis of agronomic and fiber quality traits in an intraspecific population[J]．J Cotton Sci，2011，4：161-170．
[9]8 Zhang Z S，Xiao Y H，Luo M，et a1．Construction of a genetic linkage map and QTL analysis of fiber—related traits in upland cotton(Gossypium hirsutum L) [J]．Euphytica，2005，144：91-99．[10]Wright R J，Thaxton P M，E1一zik K M，et a1．D—subgenome bias of Xcm resistance genes in tetraploid Gossypium(cotton)suggests that polyploid formation has created novel avenues for evolution[J]．Genetics，1998，149：1987-1996．
[11]张忠臣,战秀玲,陈庆山,等. 大豆QTL定位的研究进展[J].大豆科学,2004,23(3):223-227.
[12]H.R.Boerma,M.A.R.Mian. Application of DNA markers for selection of intractable soybean traits [J]. Korea Soybean Digest.1998, 15(2):106-121.
[13]FRARY A，NESBITT T C，GRANDII 1 OS，et a1．fw2．2：a quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit sized．Science，2000，298：85— 88
[14]NESBITT T C ，TANKSI EY S D．Comparative sequencing in the genus Lycopersit：im plicationsforthe evolution offruit sizeinthe domestication of cultivated tomatoes[J]．Genetics，2002，l62：365—379．
[15]CONG B，LIU J，TANKSI EY S D．Natural alleles at a tomato fruit size quantitative trait locus differ by heterochronic regulatory mutations．Proc[J]．Proc．Nat1．Acad．Sti．USA．，2002，99：l3606一l3 6l1．
[16]Eyal Fridman, et al．Zooming In on a Quantitative Trait for Tomato Yield Using Interspecific Introgressions．Science，2004，305;
[17]Yano M，Kojma S，Takahashi Y，Lin H．X，and Sasaki T．，2001，Genetic control of flowering time in rice，a short-day plant,Plant Physi，127：1425．1429
[18]Takahashi Y，Shomura A，Sasaki T，and Yano M．，2010，Hd6，a rice quantitative trait locus involved in photoperiod sensitivi—ty，encodes the a subunit of proteinkinase CK2，Proc．Nail．Aead．Sci．，98(14)：7922—7927
[19]Monna ．，Lin H．X，Kojim S．，Sasaki T，and Yano M，2002，Genetic dissection of a genomic region for quantitative trait CBS，Hd3，into two loci，Hd3a and Hd3b，controlling heading date in rice，Theor．Appl．Genet．，104：772-778
[20]Yamamoto T，Kuboki Y，Lin S．Y，Sasaki T，and Yano M，1998，Fine mapping of quantitative trait loci Hd—1，Hd一2 andHd一3，controlling heading date office，as single Mendelian factors，Thcor．Appl．Genet．，97：37—44
[ 21]KobayashiY，KayaH，Goto K，1wabuchi M，and Araki T，1999，A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals，Science，286：1960—1962
[22]Ren Z．H，Gan J．P，and Li L．G，2005，A rice quantative trait locus for salt tolerance encodes asodium transporter，Nat．Genet．，37：1141．1146
[23]THOMsBERRY J M，GOODMAN M M，DOEBI EY J，et a1．Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering,ime[J]．Nat．Genet，201l，28：286— 289．
[24]J. Doebley. et al., 2006. A distant upstream enhancer at the maize domestication gene tb1, has pleiotropic effects on plant and inflorescent architecture. Nature Genetics 38: 594-597。