超高效液相色谱法测定不同产地白芷中6种香豆素类成分

超高效液相色谱法测定不同产地白芷中6种香豆素类成分何冰倩;关旸;史冬玲;盛振华
【摘要】白芷样品粉末(约2.5 g)用25 mL甲醇浸泡过夜后超声提取30 min,加入适量甲醇补足所失质量,提取液经0.22μm有机膜过滤,采用超高效液相色谱法测定滤液中6种香豆素类成分的含量.以Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱为分离柱,用乙腈和水以不同比例混合的溶液为流动相进行梯度洗脱,用紫外检测器测定.6种香豆素类成分的质量浓度在一定范围内与其对应的峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)为0.034～0.091mg·L-1.方法用于白芷样品的分析,加标回收率为
93.2％～107％,测定值的相对标准偏差(n=6)为0.64％～1.7％.对9个不同产地的白芷样品中6种香豆素类成分的含量进行聚类分析和主成分分析,结果表明:聚类分析和主成分分析的结果一致,样品被分为3类.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2019(055)005
【总页数】5页(P602-606)
【关键词】超高效液相色谱法;聚类分析;主成分分析;香豆素;白芷
【作者】何冰倩;关旸;史冬玲;盛振华
【作者单位】浙江中医药大学中医药科学院,杭州 310053;浙江中医药大学中医药科学院,杭州 310053;浙江中医药大学中医药科学院,杭州 310053;浙江中医药大学中医药科学院,杭州 310053
【正文语种】中文
【中图分类】O652.63
白芷为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根。

白芷性温、味辛,归胃、大肠、肺经,可
解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓[1]。

现代药理作用表明白
芷中的香豆素类成分具有解热、镇痛、抗炎、扩血管、抗血小板凝集、降血压作用等[2]。

白芷来源广泛,四川遂宁是白芷之乡,其产的白芷也称川白芷。

另有杭白芷,现主要在安徽、江苏、浙江、湖南等地广泛种植。

白芷主要成分为香豆素类、挥发油以及生物碱等[3-4]。

同时测定白芷中欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归素、紫花前胡苷等6种香豆素类成分含量的液相色谱法未有文献报道。

本工作建立超
高效液相色谱法(UHPLC),在9 min内可以完成6种成分的同时测定,安全快速且有效。

1 试验部分
1．1 仪器与试剂
Waters H-Class UPLC型超高效液相色谱仪,配Waters TUV紫外检测器;DFY-
200A型高速万能粉碎机;Milli-Q Driect 8型纯水仪。

6种香豆素类成分的混合标准储备溶液:称取适量的欧前胡素对照品(纯度96.1%)、异欧前胡素对照品(纯度99.4%)、氧化前胡素对照品(纯度98.7%)、水合氧化前胡素对照品(纯度99.5%)、白当归素对照品(纯度99.7%)、紫花前胡苷对照品(纯度99.9%),加甲醇制成含212.6 mg·L-1欧前胡素、110.0 mg·L-1异欧前胡素、106.1 mg·L-1氧化前胡素、112.2 mg·L-1水合氧化前胡素、100.4 mg·L-1白当
归素、104.1 mg·L-1紫花前胡苷的混合标准储备溶液。

所有溶液均置于4 ℃冰箱避光保存,使用前需恢复至室温后过0.22 μm有机膜。

甲醇、乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,试验用水为去离子水(电阻率为18.2
MΩ·cm)。

1．2 色谱条件
Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),柱温35 ℃;流量0.4 mL·min-1;进样量1 μL;检测波长305 nm。

流动相:A为乙腈,B为水。

梯度洗脱程序:0～1.5 min时,A由10%升至30%;1.5～3.0 min时,A由30%升至60%;3.0～6.0 min时,A由60%升至90%;6.0～7.0 min时,A由90%降至10%,保持2.0 min。

1．3 试验方法
从四川、安徽、湖南、广西、湖北等省市的9个产地收集白芷(干燥根),样品
1,2,3,4,5,6,7,8,9的产地依次为四川遂宁、四川攀枝花、安徽亳州、河北保定、安徽六安、广西玉林、陕西渭南、河南许昌、湖南湘西。

将上述白芷样品均匀切片后于45 ℃烘干至恒重,粉碎后过355 μm(50目)筛备用。

分别称取已粉碎过筛的样品约2.5 g置于具塞锥形瓶中,加入25 mL甲醇混匀后称重,浸泡过夜后超声提取30 min,加入适量甲醇补足所失质量,提取液经0.22 μm有机膜过滤后[5],取滤液按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论
2．1 色谱行为
按色谱条件对6种香豆素类成分的混合标准溶液进行测定,其色谱图见图1。

6种香豆素类成分中,白当归素与水合氧化前胡素的结构较为相似,因此它们的保留时间较为接近。

试验通过对流动相酸度、梯度洗脱条件等进行优化,使两者的分离度达到了1.88。

2．2 标准曲线和检出限
移取6种香豆素类成分的混合标准储备溶液适量逐级进行稀释,得欧前胡素质量浓度依次为212.6,170.1,42.52,21.26,10.63,2.126 mg·L-1、异欧前胡素质量浓度依
次为110.0,88.00,22.00,11.00,5.500,1.100 mg·L-1、氧化前胡素质量浓度依次为106.1,84.88,21.22,10.61,5.305,1.061 mg·L-1、水合氧化前胡素质量浓度依次为112.2,89.76,22.44,11.22,5.610,1.122 mg·L-1、白当归素质量浓度依次为
100.4,80.32,20.08,10.04,5.020,1.004 mg·L-1、紫花前胡苷质量浓度依次为104.1,83.28,20.82,10.41,5.205,1.041 mg·L-1的混合标准溶液。

上述混合标准溶液系列过0.22 μm有机膜后按色谱条件进行测定,以6种香豆素类成分的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

结果表明:6种香豆素类成分的质
量浓度在一定范围内与其对应的峰面积呈线性关系,6种香豆素类成分的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。

1-紫花前胡苷;2-水合氧化前胡素;3-白当归素;4-氧化前胡素;5-欧前胡素;6-异欧前
胡素图1 混合标准溶液的色谱图Fig. 1 Chromatogram of mixed standard solution
根据3倍信噪比计算得6种香豆素类成分的检出限(3S/N),结果见表1。

表1 线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限Tab. 1 Linearity ranges, linear regression equations, correlation coefficients and detection limits化
合物线性范围ρ/(mg·L-1)线性回归方程相关系数检出限ρ/(mg·L-1)欧前胡素
2.126～212.6y=6.107×103x+
3.295×1030.999 90.053异欧前胡素1.100～110.0y=7.701×103x-5.844×1030.999 20.055氧化前胡素1.061～
106.1y=7.315×103x-7.049×1030.999 60.083水合氧化前胡素1.122～
112.2y=6.677×103x-1.885×1030.999 40.034白当归素1.004～
100.4y=4.406×103x-6.12×1020.999 90.091紫花前胡苷1.041～
104.1y=6.543×103x+2.404×1030.999 40.035
2．3 精密度和回收试验
按色谱条件对6种香豆素类成分的混合标准溶液连续进样6次。

结果表明:欧前胡
素、异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归素、紫花前胡苷峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.51%,0.67%,1.2%,0.89%,1.0%,1.7%。

按试验方法对白芷样品2进行分析,平行测定6次,并进行加标回收试验,计算回收率和测定值的RSD。

精密度和回收试验结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=6)Tab. 2 Results of tests for precision and recovery(n=6)化合物测定值w/(mg·g-1)加标量w/(mg·g-1)测定总量w/(mg·g-1)回收率/%RSD/%欧前胡素1.331.212.581031.0异欧前胡素
0.7360.7021.4094.61.7氧化前胡素0.043 80.052 00.099 31070.83水合氧化前
胡素0.1200.1200.23696.71.3白当归素0.080 40.082 20.1631000.64紫花前胡
苷0.010 20.010 30.019 893.21.5
2．4 稳定性试验
按试验方法对样品2进行处理,室温密封放置,分别于0,2,4,8,12,24,48 h进行测定。

结果表明:欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归素、紫
花前胡苷峰面积的RSD依次为0.32%,0.61%,0.83%,0.22%,0.57%,0.69%。

2．5 样品分析
按试验方法对样品1～9进行分析,样品1的色谱图见图2。

样品分析结果见表3。

由表3可知:不同产地的白芷样品中6种香豆素类成分含量存在明显差异;欧前胡素为含量最高的香豆素类成分,最高含量约为最低含量的4倍;紫花前胡苷为含量最低的香豆素类成分,最高含量为最低含量的11倍;氧化前胡素最高含量和最低含量之
间相差也较大。

1-紫花前胡苷;2-水合氧化前胡素;3-白当归素;4-氧化前胡素;5-欧前胡素;6-异欧前
胡素图2 样品1的色谱图Fig. 2 Chromatogram of the first sample
表3 样品分析结果Tab. 3 Analytical results of the samples mg·g-1样号欧前胡素异欧前胡素氧化前胡素水合氧化前胡素白当归素紫花前胡苷
11.980.820.390.440.260.1120.880.610.050.150.090.0332.230.800.350.400.26 0.0741.230.860.060.560.310.0150.920.550.030.060.010.0161.280.750.050.11 0.080.0173.261.011.590.430.240.0482.821.371.620.240.140.0892.140.570.08 0.310.190.06
2．6 聚类分析和主成分分析
采用IBM SPSS Statistics 22软件对6种香豆素类成分的含量进行聚类分析[6],选用组间联结法,采用欧式距离作为药材样品的测度,聚类分析树状图见图3。

图3 聚类分析树状图Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis
由图3可知:9个产地的白芷样品可分为3类,第一类为样品2,5,6;第二类为样品1,3,4,9;第三类为样品7,8。

采用SIMCA 14.1分析软件对6种香豆素类成分的含量进行主成分分析(PCA),样品的PCA结果见图4。

图4 样品的PCA结果Fig. 4 PCA results of the samples
由图4可知:9个样品在图中被明显分为3类,样品7,8为一类,样品2,5,6分为一类,样品1,3,4,9归为一类。

这与聚类分析的结果一致。

根据聚类分析及主成分分析结果可知:依照各产地白芷样品中6种香豆素类成分含量,可将其分为3类。

其中样品7,8的产地均属于暖温带半湿润性气候,年降水量为580 mm;样品2,5,6的产地为亚热带湿润季风气候,年降水量充沛,均大于1 100 mm;样品1,3,4,9的产地为亚热带湿润或季风性气候,样品3的产地气候也为暖温带半湿润气候,但其年平均降水量约为样品7,8产地的两倍。

中药材质量不同的原因不仅与其生长的气候环境相关,也与药材生长的土壤质量、种收时间以及保存炮制方式相关[7]。

本工作采用超高效液相色谱法测定9个不同产地白芷中欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、水合氧化前胡素、白当归素、紫花前胡苷等6种香豆素类成分的含量,比较不同产地白芷中香豆素类成分的差异并进行聚类分析和主成分分析,为完善白芷的质控标准提供科学依据。

参考文献：
【相关文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[M].北京:中国医药科技出版社, 2015．
[2] 周爱德,李强,雷海民.白芷化学成分的研究[J].中草药, 2010,41(7):1081-1083．
[3] 朱艺欣,李宝莉,马宏胜,等.白芷的有效成分提取、药理作用及临床应用研究进展[J].中国医药导报, 2014,11(31):159-162．
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