pCDNA 3.1／ EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达

pCDNA 3.1／EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达
目的为明确EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用，课题组体外构建pCDNA 3.1/EC-SOD真核表达载体，并观察其在THP-1单核源性巨噬细胞中的表达情况。

方法重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后，借助Lipofectamine 2000将转染到THP-1单核源性巨噬细胞中，24h后倒置荧光显微镜下观察转染情况。

结果重组质粒经酶切鉴定、PCR和测序分析后，证实pCDNA 3.1/EC-SOD质粒构建成功。

将pCDNA 3.1/EC-SOD通过脂质体转入THP-1单核源性巨噬细胞后，倒置荧光显微镜下观察转染效率。

结论pCDNA 3.1/EC-SOD 载体构建成功，并成功在THP-1单核源性巨噬细胞中表达，为研究EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定了基础。

标签：EC-SOD；THP-1单核源性巨噬细胞
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是体内重要的抗氧化防御系统，包括铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）以及最近日益得到重视的细胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）[1]。

EC-SOD是Marklund等在1982年发现的一种分泌型糖蛋白，主要由巨噬细胞和血管平滑肌细胞产生，它是惟一分布在细胞外发挥抗氧化作用的酶，对机体的氧化/抗氧化平衡起至关重要的作用[2，3]。

EC-SOD可以清除脂质过氧化物、减轻氧自由基对组织细胞的过氧化损伤，并能降低脂质过氧化物形成，从而保护血管内皮免受氧自由基的损伤，防止动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的形成[4，5]。

为了更深层次的研究EC-SOD的作用机理，我们构建了PcDNA-3.1/EC-SOD真核表达载体，并成功转染了THP-1单核源性巨噬细胞，为进一步研究EC-SOD的作用奠定了基础。

1资料与方法
1.1主要实验仪器和试剂大肠杆菌DH5α（北京博迈德生物技术有限公司）；PcDNA-3.1（+）质粒由本实验室保存；DNA 相对分子质量maker、限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶（Fermentas公司）；Taq DNA 聚合酶、dNTP （Takara公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；质粒小量制备试剂盒、DNA纯化回收试剂盒（Axygen公司）。

HF160W CO2孵箱（上海力申科学仪器技术公司）；CKX31相差显微镜（OL YPUS公司）；721-型分光光度计（惠普上海分析仪器有限公司产品）。

RPMI-1640培养基（GIBCO.BKI公司）；高速低温离心机（艾本德公司）；Universal HoodⅡ型凝胶成像系统和酶标仪680 （Bio-Rad公司）；实时荧光定量基因扩增仪FTC-3000 （Funglyn Biotech公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、同型半胱氨酸、MTT、二甲基亚枫DMSO （Sigma公司）；Trizol（Invitrogen 公司），逆转录试剂盒和荧光PCR试剂盒（Fermentas公司），引物由上海生工公司合成。

1.2方法
1.2.1 THP-1单核源性巨噬细胞的培养THP-1单核细胞加入含15%胎牛血清的RPMI-1640培养液，于5% CO2、37℃的培养箱中培养，以2×106个/ L接种于培养瓶中，加入浓度为500 μmol/ L的PMA后培养48 h，显微镜下观察细胞贴壁状态和分化情况，证实THP-1单核细胞是否分化为巨噬细胞。

1.2.2 EC-SOD基因的PCR扩增收集培养的巨噬细胞，以提取总RNA作为逆转录模板，以cDNA为模板扩增EC-SOD基因编码区域序列，上游引物：5’-CCCAAGCTTATGCTGGCGCTACTG TGTTC-3’ （划线处为Hind Ⅲ酶切位点）；下游引物：5’-CGGAATTCTCAGGCGGC CTTGCACTCG-3’ （划线处为EcoR Ⅰ酶切位点），产物大小为718bp。

反应体系如下：GC Buffer 12.5 L，cDNA 1 L，dNTP 4 L，Taq DNA 聚合酶0.25 L，游引物各0.5 L，6.25 L H2O。

PCR反应参数为95℃预变性4 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30s，扩增35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 pCDNA 3.1/EC-SOD重组质粒的构建将PCR产物电泳后回收目的片段。

载体质粒pCDNA -3.1和目的片段分别酶切.酶切后回收产物，按照如下连接反应体系进行连接，：T4 DNA 连接酶2L，pCDNA 3.1载体质粒2L，目的片段8L，3L Buffer，H2O 5 L。

将连接反应產物转化入DH5α细胞，接种到含氨苄青霉素的LB培养基上37℃培养过夜。

1.2.4重组质粒的筛选鉴定从转化克隆中挑取单个均匀菌落行PCR鉴定，将阳性的菌落接种LB培养基中摇菌过夜。

提取重组质粒，并行双酶切鉴定。

将阳性的重组细菌，进行DNA测序分析。

1.2.5脂质体转染THP-1单核源性巨噬细胞将巨噬细胞，弃去培养液，用PBS清洗细胞，加入1 mL无血清无抗生素的RPMI-1640培养基。

按质粒DNA （g）与LipofectamineTM 2000（L）1：2的比例，将DNA于500 L无血清培养基中稀释；LipofectamineTM 2000使用前轻轻混匀，取适量稀释在500 L无血清培养基中并与稀释的质粒DNA混合后将混合物加到培养瓶中，培养5 h后弃去转染液，换用10%胎牛血清的培养液继续培养24 h，利用荧光显微镜观察重组载体在细胞中的表达情况，收集细胞作进一步分析。

2结果
2.1重组质粒的酶切鉴定和测序分析阳性克隆经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后得和两个片段，符合预计结果（见图2）。

测序分析结果与Genebank 上述ECSOD mRNA序列（NM_003102.2 ）比对分析表明，核苷酸序列的同源性为99.99%，有一处位点的碱基序列发生了变化，氨基酸序列同源性为100%，属无义突变，DNA 测序峰值均匀一致（见图2），说明扩增到的EC-SOD是正确的。

2.2重组质粒pCDNA
3.1/EC-SOD转染巨噬细胞将重组质粒pCDNA
3.1/EC-SOD转染巨噬细胞24 h后，在荧光显微镜下观察到巨噬细胞内表达大量的绿色荧光蛋白（见图3）。

2.3重组pCDNA
3.1/EC-SOD在巨噬细胞中的表达将重组质粒pCDNA
3.1/EC-SOD转染巨噬细胞24 h后，收集细胞后分别采用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法检验EC-SOD的表达。

如图4A所示：分别与对照组和空质粒组相比pCDNA 3.1/EC-SOD组中EC-SOD mRNA的表达分别升高1.72倍和1.91倍（P＜0.01）；同时，EC-SOD的蛋白表达在重组质粒组中分别升高了1.68倍和1.87倍（P＜0.01）。

A：重组pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬细胞中mRNA的表达；B：重组pCDNA 3.1/EC-SOD在巨噬细胞中蛋白的表达。

**P＜0.01，与对照组相比；△P＜0.05，与空质粒组相比。

3讨论
随着我国经济社会的不断发展，心脑血管疾病的发病率逐年升高，已经排在各种疾病之首。

其中，动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）及其并发症在心脑血管疾病中占了相当大一部分，由AS导致的心肌梗死、脑梗死以及冠心病等心脑血管疾病，在目前人类病死原因中居首位。

因此，关于AS发病机制的研究一直是国内外学者的研究焦点。

基体在正常情况下处于氧化和抗氧化的动态平衡，当在某些因素的刺激下会打破这种平衡，发生氧自由基产生与清除间的失衡，导致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）蓄积，引起蛋白发生氧化损伤，进一步导致其结构和功能紊乱，从而发生氧化应激[6]。

氧化应激主要通过诱导血管炎症基因表达的改变、启动过氧化作用、加速炎症反应，促进细胞增殖等途径参与调控了AS的进展[7]。

若细胞内氧自由基的产生大于清除，或外源性氧化物质摄入过量时，机体会加速氧化物质的清除，而防御系统来抵抗氧自由基造成的损伤。

其中细胞外超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）可以通过催化超氧阴离子自由基而产生歧化反应，而保护机体细胞免受自由基的攻击和损害。

EC-SOD是唯一分布于细胞外并发挥抗氧化功能的酶，主要由巨噬细胞和血管平滑肌细胞分泌，是血管壁中酶的重要来源[8]。

在细胞外，EC-SOD可以与细胞表面硫酸乙酰肝素结合，催化超氧阴离子自由基（O2-·）歧化生成过氧化氢（H2O2），H2O2进一步生成水，从而清除O2-·，以保护组织和细胞免受自由基的损伤，参与阻止AS的形成。

近年来，大量临床和流行病学资料及循证医学证据表明[9，10]，高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia，HHcy）可通過增加自由基的生成，引起脂质和内皮细胞的氧化损伤；促进血管平滑肌细胞增殖；诱发胰岛素抵抗；并进一步诱发AS的发生发展，是继高血压、高血脂、糖尿病、吸烟、肥胖等因素后AS的又一独立危险因素。

同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是一种含硫氨基酸，在体内主要通过甲硫氨酸循环和转硫途径代谢，而发挥生物学效应。

本文中成功在体外构建EC-SOD的重组载体并利用liposuction 2000TM转染入巨噬细胞且成功表达。

在AS进展过程中，EC-SOD作为唯一在细胞外发挥抗氧化作用的酶，其所保护作用及作用机制仍有待进一步的研究。

EC-SOD发现之初，其功能和作用并未受到大家足够的重视和关注。

EC-SOD在抵抗氧化物诱导的组织损伤方面发挥
着非常重要的作用，因此，深入研究其作用机制将为提高机体抗氧化能力和重建自由基平衡提供新的治疗靶点，同时也为预防和治疗心脑血管疾病开拓了新的途径。

参考文献：
[1]Molina-Rueda JJ，Tsai CJ，Kirby EG.，et al. The Populus Superoxide Dismutase Gene Family and Its Responses to Drought Stress in Transgenic Poplar Overexpressing a Pine Cytosolic Glutamine Synthetase （GS1a）[J].PLoS One，2013，8 （2）：56421.
[2]Marklund SL.Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，79（24）：7634-7638.
[3]Oury TD，Day BJ，Crapo JD.Extracellular superoxide dismutase in vessels and airways of humans and baboons[J].Free Radic Biol Med，1996，20：957-965.
[4]张庆军，刘德培，梁植权.动脉粥样硬化的基础研究[J].中华医学杂志，2005，85（6）：428-431.
[5]Chanvorachote P，Chunhacha P.Caveolin-1 Regulates Endothelial Adhesion of Lung Cancer Cells via Reactive Oxygen Species-Dependent Mechanism[J].PLoS One，2013，8（2）：e57466.
[6]Selek S，Savas HA，Gergerlioglu HS，etal. The course of nitric oxide and superoxide dismutase during treatment of bipolar depressive episode[J].J Affect Disord，2008，107（1-3）：89-94.
[7]Vesentini N，Kusmic C，Battaglia D，et al. Modulation of erythrocyte sensitivity to oxidative stress by transient hyperhomocysteinemia in healthy subjects and in patients with coronary artery disease[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2008，18（6）：402-407.
[8]Lawrence de Koning AB，Werstuck GH，Zhou J，et al. Hyperhomocysteinemia and its role in the development of atherosclerosis[J].Clin Biochem，2003，36（6）：431-441.
[9]Sobczak AJ.The effects of tobacco smoke on the homocysteine level--a risk factor of atherosclerosis[J].Addict Biol，2003，8（2）：147-158.
[10]Enneman AW，van der Velde N，de Jonge R，et al.The association between plasma homocysteine levels，methylation capacity and incident osteoporotic fractures[J].Bone，2012，50 （6）：1401-1405.。