草鱼出血症的诊断与防治方法研究进展

草鱼出血症的诊断与防治方法研究进展
摘要：草鱼是大型鲤科经济鱼类，为我国四大家鱼之一，也是我国养殖产量最高的鱼类。

然而，由呼肠孤病毒引起的草鱼出血病是危害草鱼最为严重的病毒性疾病，给养殖者造成重大的经济损失。

因此，建立简单、快速的检测技术和有效的预防与治疗措施对于草鱼出血症的疾病控制相当重要。

本文主要从草鱼出血症的诊断及防治方法的研究进展做一综述。

关键词：草鱼出血症；诊断；防治
Resent progress about diagnosis and prophylaxis methods of Grass Carp Hemorrhage Virus
Abstract:Grass carp as one of four famous fish in our country is a large cyprinidae economic fish, also is the highest fish farming production. However, grass carp reovirus hemorrhagic a serious viral disease caused great economic losses for farmers. Therefore, to establish a simple and rapid detection technology and effective prophylaxis and treatment measures for grass carp out of disease control is quite important. This article mainly outlines the grass carp disease diagnosis and prevention methods.
Key words:Grass Carp Hemorrhage Virus;diagnosis;prophylaxis 草鱼因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的“四大家鱼”之一，其产量约占淡水养殖总产量的20％。

草鱼出血病1970年首先在湖北黄破县摄口水产养殖场发现，流行于湖北、广东、广西、江西、
江苏、浙江、福建、上海、河南、河北、四川等省、市、自治区的主要养殖地区，2006 年草鱼因病害问题损失达21.26 亿元，约占鱼类病害损失的39.47%，也是因病害问题损失最大的经济鱼类[1]。

尤其是由草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病，发病快、流行广、死亡率高，是危害草鱼最为严重的病毒性疾病，常给养殖者造成重大的经济损失。

目前，对草鱼出血病重点放在预防和控制方面，没有十分有效的治疗方法。

因此草鱼出血病的防治成为我国水产研究中的一个重要课题。

建立快速、简单的疾病检测技术与有效的防治手段对于养殖业来说相当重要。

本文将主要从草鱼出血症的常用检测技术与防治方法两方面做一综述。

1 草鱼出血症病原学研究
草鱼出血病主要流行我国南方。

1978年由中科院水生所揭示出此病由病毒引起。

1983年中科院武汉病毒所首次成功分理出病毒，肾脏是此病毒侵袭最严重的器官。

许多科学家在病毒靶器官、组织病理、病理生理方面做过较详细的研究[2]。

通过病毒形态结构和基因组分析，确定为呼肠孤病毒科成员。

暂定为鱼呼肠孤病毒。

以后经过众多学者对鱼呼肠孤病毒的形态结构、繁殖特性、多肽组成、基因组、RNA聚合酶、血清学、流行病学等方面的体统研究，揭示其具有呼肠孤病毒科主要特征，但不属于当时已知的6个属中的任何一个，是呼肠孤病毒科的新品种，定名为草鱼出血病病毒（GCHV）。

此病毒具有20面体对称的球状结构，直径为71nm，双层衣壳，无囊膜，核心衣壳约50nm，具有12个钉状突起。

病毒颗粒有11种多肽组成，
其中至少有5种是糖蛋白。

病毒基因组由11条双链RNA组成，分子量范围在0.5×106-3.1×106，体外转录和体内转录实验均证明此病毒核心具有内源依赖于RNA的RNA聚合酶，最适酶活温度为28℃。

GCHV 对热（56℃），酸（pH3），碱（pH10）均有一定耐受性、对氯仿、乙醚不敏感。

2 草鱼出血症的诊断方法
目前对各类疾病进行简单、快速的诊断主要用免疫酶联吸附试验和聚合酶链式反应。

与经典生物学和化学方法相比，ELISA方法具有以下特点：灵敏度高，其检测限可达到ng甚至pg水平，并可作定量测定；特异性强，抗原抗体特异性发生免疫应答反应，结构类似物对检测干扰很小；操作简单方便，特别适合于对大规模样品的检
测；安全性高，对环境污染程度低，减少了对检测人员和环境的潜在危害。

2.1 免疫酶联吸附（ELISA）
斑点免疫吸附ELISA(Dot-ELISA)是近年建立的一种新的免疫检测技术，具有操作简便、灵敏度高等优点而在动植物病毒检测中得到广泛应用。

邵建忠等[3]报道了斑点免疫吸附ELISA(Dot-ELISA)快速检鳓草鱼出血病病毒(GCHV)的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织的检测结果，并对该方法的灵敏度与SPA-CoA和常规ELISA法进行了系统的比较。

结果表明，Dot-ELISA检出GCHV的最低古量为3pg，该灵敏度It：SPACoA和常规ELISA法分别提高10倍和20倍，而且快速易行，是目前检测GCHV最为有效的方法，并
可在草鱼出血病临床诊断和病毒疫苗质量鉴定等方面得到应用。

曾伟伟等[4]利用所述的单克隆抗体构建了一种草鱼呼肠孤病毒间接ELISA 检测试剂盒，所述试剂盒中包括抗草鱼IgM的单克隆抗体的酶标记物，包被有抗原的酶标板。

本发明所构建的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型ELISA 检测试剂盒可以对草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型特异性抗体的进行定性或定量检测，同时可以检测草鱼多份血清样品并达到早期诊断的目的，对草鱼出血病的诊断、流行病学调查和病原监测具有较高的临床使用及推广价值。

吴礼龙等[5]运用间接的ELISA技术测定了草鱼出血病病毒(GCHV)毒力及其免疫疫苗效价，该方法简单易行，30 min内即可从1/100未经提纯的毒液或疫苗中检测出抗原。

2.2 聚合酶链式反应（PCR）
王晓丰等[6]根据GenBank中GCRV VP6蛋白基因保守序列设计引物，以GCRV弱毒疫苗株GCHV-892总RNA为模板，RT-PCR反应扩增出712 bp的目的条带，并对PCR反应体系和反应程序进行了优化，测定了该方法的敏感性和特异性。

敏感性试验结果表明以含VP6蛋白基因的重组质粒为模板，该PCR方法的最低检测限为102 copies·uL-1，特异性试验表明该引物仅能扩增GCRV核酸，而与白斑综合征病毒(WSSV)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)无交叉反应性。

应用所建立的RT-PCR方法检测了7份疑似出血病草鱼病样，3份病料获得了阳性扩增，随机挑选中的1份阳性样品经克隆后测序，结果显示与GenBank中已知序列最高有99％的相似性。

王铁辉等[7]建立的RT-PCR技术仅能够特异性
的枪测GCRV-861毒株；Zhang等[8]报道的RT-PCR反应能够用于检测GCRV-991，876，875和873毒株，扩大了该方法的适用范围，但是对于新近分离的HZ08和GDl08毒株则未有研究。

Zhou等[9]利用GCRV的VP6蛋白克隆进pEGFP-N1载体构建pEGFP-N1-VP6质粒。

建立了一种使用探针的实时定量PCR来检测GCRV。

1×101/ul-1×106/ul的病毒拷贝量都可以检测。

Seng等[10]报道设计简并引物，用于检测水生呼肠孤病毒属的鲅呼肠孤病毒(Threadn reovirus．TFV)、孔雀鱼呼肠孤病毒(Guppy reovirus，GPV)和GCRV，同样这些病毒之间序列差异较大。

3 草鱼出血症的防治方法
3.1 疫苗防治
我国鱼用疫苗的研究虽然起步较晚，但对草鱼出血病的免疫预防分别从灭活疫苗、减毒疫苗、基因疫苗等方面进行了研究，并取得了突破性进展。

灭活疫苗又称死疫苗，系采用加热、使用灭活剂等理化方法在确保免疫原性不受影响的情况下将活病原微生物杀死而制成。

从1973年起，中国科学院水生生物研究所、中国水产科学研究院长江水产研究所等就开始研制草鱼出血病细胞培养灭活疫苗，并且取得了明显的成效[11,12]。

减毒疫苗又称弱毒疫苗或活疫苗，是应用减毒或无毒的活病原微生物制成。

许淑英等[13]研究结果表明，用减毒疫苗免疫草鱼后，草鱼的成活率和免疫保护率均达100％。

基因疫苗是将某一病原的主要免疫原性蛋白的密码基因DNA转移、重组后获得的。

章怀云等[14]
纠采用外源DNA处理方法，将鲤鱼精液、肝脏的总DNA以精子载体处理草鱼受精卵，获得了数批经外源DNA处理的草鱼群体。

研究结果表明。

经鲤鱼总DNA处理的当年草鱼对草鱼出血病病毒的抗性显著增强。

XU等[15]使用呼肠孤病毒的VP7基因构建质粒转化大肠杆菌，制得重组蛋白，变性后按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组，以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。

经SDS-PAGE电泳分析，发现了相对分子质量为34000的蛋白表达带；Western Blot 检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性；间接凝集试验结果表明，3个免疫组均有抗体产生；攻毒试验结果表明，0.5、1.0、2.0 mg/尾重组蛋白剂量组的保护率分别为90%、85%、90%，对照组为0，表明所构建的疫苗具有较好的免疫作用。

对草鱼出血症疫苗的优缺点比较，组织灭活疫苗优点是研制周期短，使用安全，易于保存，缺点是使用剂量大，接种后不能再体内产生长久免疫，需要加入适当的佐剂以增强免疫效果。

减毒活疫苗的优点是能在体内繁殖，不必添加佐剂，免疫周期长，不影响肉类品质，且有些弱毒苗可以刺激机体细胞产生干扰素。

缺点是贮存运输不方便，保存时间短，成本和生产技术要求高。

亚单位疫苗副作用少，不易致癌及回复突变，疫苗以直接被合成或通过重组DNA技术生产，缺点是制备过程复杂，成本高，要求技术含量高。

3.2 中草药防治
中草药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、资源丰富以及性能多样化等优点，在防治鱼病中，开发和利用中草药不仅解决
了抗生素及其替代品不能解决的药物残留问题，而且能显著提高我国渔业生产水平及产品质量。

周正度等[16]报道中药方剂“鱼康灵”可防治草鱼血病，菊花、金银花、黄柏、青木香、樟脑、苦参、食盐合剂煎汁后全池泼洒，可防治鱼类出血、烂鳃、肠炎并发症。

姜德山和李丙文[17]则以清瘟败毒饮治疗草鱼出血病，按鱼体重的0.3%做成药饵喂服，5d后未见死鱼，至出塘未见复发。

赵忠民[18]通过每100千克鱼每天用0.5千克大黄、黄芩、黄柏、板蓝根单用或合用，再加0.5千克食盐拌匀投饲，连喂7天，再适当加些抗菌素类药，或每100千克鱼每天用刺槐子、苍生2号和食盐各0.5千克拌匀投饲，连喂两天，还可以每100千克鱼每天用鱼复药2号4克左右拌饲投喂，连喂3天来预防草鱼出血症。

中草药虽然在防治鱼病方面有一定的功效，但在实际应用中也存在许多问题，集中表现在以下几个方面：滥用偏方，配方不合理；
加工工艺落后，理论研究较少，缺少专业用语，药效慢、使用麻烦和某些原材料价格偏高等。

因此，充分发挥中草药在防治鱼病方面应有的作用还需要很大的努力。

3.3 干扰素防治
干扰素(Interferon，IFN)是一种重要的细胞功能调节因子，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功能，是现代生物学、医学等研究中一个十分活跃的领域。

但目前对IFN的研究主要见诸于人类和高等脊椎动物，就低等动物的鱼类研究尚处起步阶段。

苏建明等[19]采用显微注射法将人A-干扰素抗病基因转移到草鱼受精卵中，获得转基因群体，
通过PCR及Southern杂交对转基因草鱼进行分子水平的检测，以进一步验证外源人A-干扰素是否整合人草鱼基因组，结果表明，外源人A-干扰素抗病基因已整合入草鱼基因组中。

采用腹腔注射法，对转基因鱼进行草鱼出血病病毒接种攻毒试验。

结果显示，转基因草鱼比对照组的抗病毒能力有显著提高。

贾方钧等[20]对人工诱导的鲫鱼干扰素防治草鱼出血病的效果进行了研究，结果表明，人工诱导的鲫鱼干扰素确能有效防治草鱼出血病。

腹腔注射和药浴浸泡两种途径均有一定效果。

D Li[21]等使用重组干扰素融合蛋白通过腹膜注射鱼口服的方式免疫草鱼，发现使用1ug/g鱼体重注射腹膜和1ug/g鱼体重连续口服2天效果最好。

干扰素虽然对草鱼出血病病原具有较强的免疫效价，但是其生产成本相对较高，而且也必须采取注射法进行接种，所以，目前也没有在生产上推广使用。

4 展望
草鱼出血病病原主要侵染在草鱼的活组织细胞中而致病。

采用化学药物治疗则因为药物难以渗入到病毒所感染的组织细胞或渗入的含量很低而达不到杀灭病毒的药量，疗效不明显。

目前人们还没有研制出能有效抑制和杀灭病毒的药物。

所采用的只是一些被动防御措施；或加强机体的免疫防护功能；或创造不利于病毒快速增殖的寄宿内环境。

草鱼出血病的疫苗防治是行之有效的方法，但由于对草鱼出血病病毒各地流行株的免疫原性尚缺乏系统的比较研究，因而尚未制备出能广泛使用的鱼用疫苗，并且各种疫苗都存在一定的缺点。

因此，对
于草鱼出血症的诊断与防治还需进行进一步的研究与探索，随着科技的进步与对草鱼出血症的进一步了解，相信一定能研制出更好的检测方法和广泛使用的治疗药物或者疫苗。

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